T淋巴瘤侵袭转移诱导因子与大肠癌上皮间质转化的关系

目的探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)与大肠癌上皮间质转化的关系。方法应用免疫组化二步法检测143例大肠正常组织、大肠癌、大肠淋巴结转移癌石蜡组织标本中Tiam1、E-cadherin、CK、vimentin的表达情况。结果(1)Tiam1在大肠癌组织中表达显著高于正常组织(P<0.01),且与大肠癌分化程度有关(P<0.05);Tiam1在淋巴结转移癌中表达显著高于大肠癌原发灶(P<0.05);(2)E-cadherin、CK在大肠正常组织中表达高于癌组织(P<0.01),在大肠癌中的表达与分化程度有关(P<0.01),但在大肠癌与淋巴结转移癌中表达差异无显著性;(3)vimentin在大肠癌中表达比正常组织高(P<0.01),且与分化程度有关(P<0.01),但在大肠癌与淋巴结转移癌中表达无显著性差异;(4)Tiam1与E-cadherin、CK表达呈负相关,与vimentin表达呈正相关。结论Tiam1与大肠癌分化和转移有关,其促进大肠癌转移的机制可能与上皮间质转化发生有关。

大肠癌错配修复基因缺失与5-氟尿嘧啶敏感性的关系

目的探讨大肠癌中错配修复基因(MMR)表达缺失与化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)药物敏感性的关系。方法选取4株大肠癌细胞株SW480、HT29、Lovo、HCT116进行细胞培养,运用MTT法分析不同细胞株对5-FU药物敏感性,采用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡情况。结果 MMR基因缺失的细胞株Lovo、HCT116对5-FU的敏感性要高于MMR基因完整的细胞株HT29、SW480,并且以MSI-H的大肠癌细胞株HCT116的敏感性最高,MSS的大肠癌细胞株HT29敏感性最低。流式细胞术分析Lovo、HT29的细胞周期,5-FU处理细胞后,细胞周期中S期的比例明显减少(P<0.05),5-FU作用细胞后抑制了细胞的增殖速度,阻断细胞的DNA合成和复制。结论 MMR基因缺失大肠癌细胞株对5-FU的敏感性明显高于MMR基因完整大肠癌细胞株,不同浓度的5-FU药物与癌细胞之间存在着剂量效应及时间效应关系。

肝癌组织基质金属蛋白酶-2和CD147的表达及临床病理分析

目的:探讨肝癌组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和CD147的表达与临床病理特征的关系。方法:应用RT-PCR和免疫组化MaxvisonTM法,分别检测56例肝癌及癌旁组织中MMP-2 mRNA,MMP-2和CD147蛋白的表达情况。结果:MMP-2 mRNA及蛋白在肝癌和癌旁组织的表达差异有统计学意义(P<0.05),但肝癌组织MMP-2 mRNA和蛋白间差异无统计学意义(P>0.05);MMP-2和CD147蛋白在Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期、转移与无转移的肝癌组织中表达差异有统计学意义(P<0.05),肝癌组织中MMP-2蛋白和CD147蛋白表达的吻合度较强(κ=0.689,P=0.000)。结论:MMP-2和CD147的表达与肝癌的TNM分期密切相关,可作为判断肝癌侵袭性的指标。

应用重组慢病毒表达载体建立抑癌基因WTX稳定高表达结直肠癌SW620细胞系

目的构建WTX CDS区全长重组慢病毒表达载体,感染结直肠癌SW620细胞,建立WTX稳定高表达结直肠癌SW620细胞株。方法将WTX基因全长CDS区插入GV287慢病毒质粒载体,重组载体与包装载体共转染人胚肾293T细胞,收集上清、浓缩得到表达WTX的重组慢病毒。慢病毒感染结直肠癌SW620细胞,荧光显微镜初步观察感染效率,G418进一步筛选得到稳定感染细胞株。QPCR及Western blotting检测WTX过表达效率。每部分均设立相应对照。结果载体片段测序结果示成功构建了WTX重组表达载体;包装病毒滴度检测适中,提示WTX表达慢病毒包装成功;慢病毒感染结直肠癌SW620细胞后,WTX基因m RNA以及蛋白表达水平明显增高,有统计学意义,提示SW620结直肠癌细胞WTX高表达稳定株构建成功。结论建立慢病毒感染方法的结直肠癌SW620细胞WTX过表达稳定细胞株,为进一步研究WTX对结直肠癌发生、发展的作用机制提供分子生物学工具。

p53、malat1、ki-67和β-catenin基因mRNA检测在大肠癌分子诊断中的意义

目的:初步研究多个大肠癌相关基因p53、malat1、ki-67和β-catenin在大肠癌分子诊断中的意义.方法:收集手术切除的新鲜大肠癌组织标本47例、大肠腺瘤组织标本13例,以及分别和大肠癌、大肠腺瘤对应的正常大肠黏膜组织标本53例,用实时荧光定量RT-PCR方法检测各基因的Ct值.结果:p53、malat1在大肠癌组表达量均高于大肠腺瘤组(P=0.026,P=0.034),但是p53在正常大肠黏膜组、大肠腺瘤组和大肠癌组中表达依次增高,而malat1在大肠腺瘤组、正常大肠黏膜组和大肠癌组中表达量依次增高,大肠腺瘤组mRNA表达最低.ki-67在大肠癌组的表达量是正常黏膜组表达量的1.42倍(P=0.007).β-catenin基因在三组间的表达差异无统计学意义.各基因的表达量均和大肠癌的分期无关.经ROC曲线分析,p53的曲线下面积是0.755(P<0.05),在大肠腺瘤组和大肠癌组的最佳Cut-off值分别是2.585、3.215,malat1的曲线下面积是0.748(P<0.05),在大肠腺瘤组和大肠癌组的最佳Cut-off值分别是0.925、1.395;二元Logistic回归分析,p53和malat1进入回归模型(P<0.05).联合检测p53和malat1在大肠腺瘤组和大肠癌组的ROC曲线下面积为0.785(P=0.01),在大肠腺瘤组的和大肠癌组的最佳Cut-off值分别是0.750、0.790.p53和malat1联合检测的ROC曲线下面积均高于单独检测的ROC曲线下面积.结论:p53和malat1在大肠癌的分子诊断中有一定的应用价值,可为鉴别大肠腺瘤和大肠癌提供有效的参考;和单独检测相比,二者联和检测的准确性高于单独检测的准确性.

Sox2下游调控蛋白的筛选及其对大肠癌细胞增殖、迁移的影响

目的分析大肠癌细胞转录因子Sox2对大肠癌细胞增殖及迁移的影响。方法应用SDS-PAGE蛋白电泳,结合考马斯亮蓝及镀胺银染色方法,筛选差异蛋白。质谱分析筛选Sox2下游调控蛋白,应用定量PCR(QPCR)及Western blotting验证和鉴定下游调控蛋白。Cell Counting Kit-8(CCK8)观察Sox2对大肠癌细胞增殖的影响,Transwell实验观察Sox2对迁移能力的影响。结果应用蛋白组学技术成功筛选出Sox2下调蛋白S3a、上调蛋白ENO1、Gama-actin。QPCR和Western blotting显示,Sox2过表达后,大肠癌细胞S3a表达减少(P<0.005),ENO1表达增加(P<0.05),Gama-actin表达无明显差异,细胞增殖及迁移能力提高(P<0.05);Sox2干扰后,大肠癌细胞S3a表达增加(P<0.05),ENO1表达减少(P<0.001),Gama-actin表达无明显差异,细胞增殖及迁移能力下降(P<0.05)。结论 Sox2负向调控S3a的表达,正向调控ENO1的表达,促进大肠癌细胞增殖及迁移。

甲基苯丙胺致大鼠神经毒性及纹状体硝化作用的改变

目的探讨甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)所导致的大鼠神经毒性及纹状体硝化作用的改变。方法建立MA给药模型,对照组给予等量生理盐水;观察两组大鼠的行为学改变,体温变化,纹状体中NO含量,NOS活性和蛋白质硝化水平的变化情况。结果MA组大鼠刻板行为评分和体温均高于对照组(P<0.01);与对照组相比,MA组大鼠纹状体NO含量及NOS活性增加(P<0.01);纹状体蛋白硝化水平明显增加(P<0.01),差异有显著性。结论MA可导致大鼠行为学改变和体温变化,大鼠脑组织NO含量、NOS活性及蛋白硝化水平的增高可能是MA中枢神经系统损伤的重要机制。

硝酸纤维素膜上培养SW480和SW1116细胞的特殊染色及结果观察

目的观察硝酸纤维素膜在体外培养细胞后进行特殊染色时,膜的理化稳定性和背景着色情况以及细胞形态和染色状况,以期拓展硝酸纤维素膜作为细胞培养介质在细胞培养技术中新的应用。方法将人结肠癌细胞接种于常规灭菌和浸泡处理过的硝酸纤维素膜上,CO2培养箱培养细胞后,进行Giemsa染色和免疫组织化学染色、并经透明处理后,观察膜的平整度及背景染色情况,在光镜下观察硝酸纤维素膜上生长的细胞染色结果和癌基因原位表达状况,并与载玻片培养、染色后的细胞爬片作比较。结果硝酸纤维素膜细胞爬片经染色、透明后呈略带背景着色的透明状态:Giemsa染色膜片背景较浅,呈淡蓝色;免疫组化染色膜片呈蓝紫色。镜下观察:细胞轮廓清晰,Giemsa染色结果较盖玻片对照组染色结果差异明显,细胞核和细胞浆均染为蓝色,胞浆未呈现正常的粉红色着色。免疫组织化学对细胞角蛋白染色结果理想,结肠癌细胞胞浆见棕黄色阳性颜色;两者背景着色对结果观察影响较小,在高倍镜下观察时影响更小。结论在硝酸纤维素膜上培养的细胞可以直接进行Giemsa染色和免疫组织化学染色;膜透明处理后具有良好的透光性,可满足光镜观察需求;细胞的目的基因原位检测染色结果理想。

CDC42沉默对结直肠癌细胞形态的影响

目的根据CDC42蛋白二级结构,设计CDC42 si RNA干扰片段,构建CDC42稳定干扰sh RNA载体。观察CDC42有效沉默对结直肠癌SW480细胞形态的影响。方法根据CDC42基因CDS区序列,设计4条si RNA片段。Western blot筛选最有效沉默片段,酶切插入真核表达载体,将构建的sh RNA质粒载体,瞬时转染结直肠癌SW480细胞,QPCR及Western blot验证CDC42沉默效率;观察转染前后,SW480细胞形态变化。结果 4条si RNA转染细胞后,验证结果显示si RNA-3沉默效率大于50%,沉默效果最好,将此片段插入真核表达载体,测序结果提示CDC42 sh RNA构建成功,转染SW480细胞后,CDC42基因m RNA及蛋白水平表达明显下降,差异有统计学意义;显微镜观察CDC42沉默后,SW480细胞周边伪足伸出减少,细胞变光滑,细胞整体体积明显减小。结论成功根据基因序列设计有效沉默片段,构建CDC42稳定沉默载体,证实CDC42沉默可以逆向改变结直肠癌细胞高侵袭性形态,为研究CDC42对结直肠癌的发生、发展提供分子工具。

细胞因子/趋化因子与经典型霍奇金淋巴瘤微环境

经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)占霍奇金淋巴瘤(HL)的95%以上并有着相当独特的病理特征,其恶性成分霍奇金-里斯细胞(H/RS细胞)只占肿瘤组织的极少部分,存在于大量浸润性炎性细胞构成的微环境中。cHL组织学亚型及临床特征与不同的微环境相关,细胞因子/趋化因子与肿瘤细胞的的交互作用维持了肿瘤赖以生存的特殊微环境。通过分析探讨cHL不同亚型的微环境特点、参与微环境的细胞因子/趋化因子种类及在cHL生存、抗凋亡和免疫抑制中的重要作用,指出针对细胞因子/趋化因子为靶点的治疗可能成为今后生物治疗策略之一。

MALAT-1基因种属同源序列重组质粒的构建及其与人鼻咽癌细胞株C666-1侵袭转移的关系

目的：运用基因重组技术构建人MAL-AT-1基因种属同源序列（Species homologous frag-ments/shf）重组真核荧光表达载体,并探讨其在MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1中的表达和对其侵袭转移的影响。方法：应用RT-touchdown PCR的方法,从鼻咽癌患者正常切缘组织中扩增出MALAT-1基因的种属同源序列,将所得的cDNA序列定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1质粒中,构建出重组真核荧光表达载体;采用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒pEGFP-C1-MALAT-1/shf瞬时转染MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1;通过实时荧光定量PCR方法检测MALAT-1基因种属同源序列转染组和空载体转染组细胞中MALAT-1/shf的表达水平;细胞基质胶侵袭实验研究转染组细胞侵袭能力的变化。结果：经酶切鉴定及测序分析,证实成功构建人MALAT-1/shf重组真核荧光表达载体。pEGFP-C1-MALAT-1/shf（6 918~8 441 bp）转染组平均侵袭细胞数（51.20±5.933）显著高于MALAT-1/mock组（13.40±3.847）,差异具有统计学意义（P=0.000）。这说明转染pEGFP-C1-MALAT-1/shf（6 918~8 441 bp）重组质粒后,细胞的侵袭能力明显增强。结论：成功构建了人MALAT-1基因种属同源序列真核荧光表达载体pEGFP-C1-MALAT-1/shf,并成功在MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1中表达,MALAT-1/shf（6 918~8 441 bp）与人鼻咽癌C666-1细胞株的侵袭转移密切相关。