脂多糖和热打击联合作用对人肠上皮细胞细胞骨架的影响

目的观察脂多糖(LPS)与热打击单独和联合作用对人肠上皮细胞细胞骨架的影响。方法培养人肠上皮细胞株(SW 480),实验分组为:对照组,热打击组(又分为热打击1、3、6 h组),LPS刺激组,热打击和LPS联合刺激组,用骨架蛋白(肌动蛋白F-actin)的特异性染料罗丹明标记的F-actin特异性结合物鬼笔环肽(rhodam ine-phalloid in)和细胞核特异性染色剂(DAPI)行免疫荧光,检测在上述刺激作用下细胞形态的改变和F-actin在细胞内分布的变化。结果相比于对照组,热打击1 h就可以使细胞轮廓变圆,细胞伪足变短变粗,细胞间间隙变大。热打击3 h时上述情况更加明显,而热打击6 h时,细胞几乎全部坏死漂浮。单独LPS作用6 h时也能看到多数细胞出现伪足变短变粗,细胞间间隙增大情况,但较单独热打击1 h组程度轻。而热打击和LPS联合作用则可看到二者间存在一定的协同作用。正常对照组细胞的F-actin呈相对均匀分布,但以细胞周边和核的周围居多,而单独LPS作用即可看到细胞骨架发生重组,出现应力纤维,而和热打击联合作用时,细胞周边的F-actin明显减少,出现明显的应力纤维(变粗、变短、紊乱,排列呈明显的非极性单向分布)。结论热打击和LPS单独作用均可使细胞形态发生明显改变,细胞骨架发生重组,细胞间间隙增大,并且二者之间存在一定的协同效应,这为理解重症中暑至多脏器功能衰竭(MODS)发生发展过程中,肠屏障细胞的通透性增加进而引发肠道细菌和内毒素移位的作用机制提供了直观的实验依据。

热打击联合脂多糖刺激对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响

目的:观察脂多糖(LPS)与热打击分别单独作用与联合作用对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响。方法:于37℃、5%CO_2标准培养箱中培养人肠上皮细胞株SW480。实验分4组:空白对照组直接收集细胞上清;LPS单独刺激组(LPS组)分别使用0、0.01、0.1、1和10μg/ml的LPS刺激SW480细胞,24 h后收集细胞上清;热打击组将SW480细胞进行热打击(42℃,1 h)后在标准孵箱分别培养1 h和24 h后收集细胞上清;LPS+热打击组将SW480细胞42℃热打击1 h后给予上述浓度的LPS刺激,再重新置于标准孵箱中培养,24 h后收集细胞上清。各组细胞上清用LiquiChip液相蛋白芯片系统分别检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等10种细胞因子/趋化因子的表达分泌水平。结果:单独LPS刺激时呈剂量依赖性诱导SW480表达分泌IL-8,对其余9种细胞因子/趋化因子的表达分泌水平影响不明显。单纯热打击仅诱导SW480细胞表达分泌IL-8的水平升高,且与空白对照组比较,仅热打击24 h后IL-8的水平显著增加(P<0.01)。热打击联合不同浓度的LPS刺激SW480细胞,LPS浓度低时并不影响SW480表达分泌IL-8的水平(P>0.05),而高浓度LPS可以显著减少其表达分泌水平(P<0.05)。结论:人肠上皮细胞SW480作为脏器实质细胞,对炎性刺激仅能产生单一种类的细胞因子,其中LPS单独刺激和一定强度的热打击均可上调SW480分泌IL-8;但高浓度LPS在热环境下可抑制SW480细胞的IL-8表达分泌水平。

脂多糖与高迁移率族蛋白B1联用对HepG2细胞释放细胞因子的影响

目的观察脂多糖（LPS）与高迁移率族蛋白B1（HMGB1）单用或联用对人肝癌细胞释放细胞因子的诱导作用。方法培养人肝癌细胞株HepG2，用原核重组表达载体pET14b—HMGB1原核表达纯化HMGB1蛋白；用不同浓度的HMGB1蛋白（0、0．01、0．1、1、10mg／L）或不同浓度的LPS（0、0．1、1、10、100mg／L）以及1mg／LHMGB1和10mg／LLPS联用分别刺激培养的HepG2，24h后收集细胞上清液，用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测上清液中粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）、γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）10种细胞因子的表达水平。结果LPS可以剂量依赖性的方式刺激HepG2分泌IL-6、IL-8表达（P〈0．05或P〈0．01），而对GM—CSF、IFN-γ、IL—1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF—α等作用不明显；不同浓度的HMGB1刺激HepG2后发现，低浓度的HMGB1可明显上调IL-6、IL-8的表达（P均〈0．01），但随着浓度升高，这种诱导作用逐渐减弱，并逐渐恢复至对照水平，而对其他8种细胞因子也无明显诱导作用。HMGB1和LPS联用时，高浓度的HMGB1可明显抑制LPS对HepG2分泌IL-6、IL-8的诱导作用（P均〈0．01）。结论人肝癌细胞株HepG2对炎性刺激仅能产生很少种类的细胞因子，其中LPS作用可以上调IL-6和1L-8水平，而HMGB1则表现出量效的反作用，并且高浓度的HMGB1可明显抑制LPS对HepG2分泌细胞因子的诱导作用。