脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景:血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的:观察脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子和纤维蛋白胶复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法:从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪干细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成5×1010L-1细胞悬液。由0.5mL细胞悬液、100μL的血管内皮生长因子工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论:术后8周取材时:①实验组可见血管增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;对照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大于对照组(P<0.01)。②苏木精-伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组(P<0.01)。③新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。结果说明脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子和纤维蛋白胶复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子共同参与新生脂肪组织的血管化过程。

脂肪干细胞与自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景:血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的:观察脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法:从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪干细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成浓度为5×1010L-1细胞悬液。由0.5mL细胞悬液、100μL富血小板血浆工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论:植入后8周取材:①实验组可见血管明显增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;对照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大于对照组(P<0.01)。②苏木精-伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组(P<0.01)。③新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。说明脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪干细胞与自体富血小板血浆共同参与新生脂肪组织的血管化过程,自体富血小板血浆能促进组织工程构建物的血运重建,保证更多种子细胞的成活。

早期应用富血小板血浆凝胶对自体脂肪组织移植存活率的影响

背景:自体颗粒脂肪组织填充广泛用于修复重建领域,移植后组织大量被吸收可严重影响远期效果。目的:观察早期应用富血小板血浆对自体移植脂肪组织存活率的影响。方法:取健康成年人腹部脂肪组织颗粒进行纯化,同时抽取少量静脉血,采用离心法提取自体富血小板血浆,利用纤维蛋白胶的物理特性制备含有富血小板血浆的脂肪组织复合移植物,在裸鼠背部中线两侧各分离一个腔隙,富血小板血浆组将脂肪组织颗粒-富血小板血浆凝胶随机注射入一侧腔隙深筋膜下,对侧仅注入脂肪组织颗粒作为对照组。结果与结论:移植后1个月和3个月,与对照组比较,富血小板血浆组移植脂肪局部的血管增生均较明显(P<0.05),脂肪质量保持率均较高(P<0.05);移植物脂肪细胞纤维坏死率均较低(P<0.05)。提示早期应用富血小板血浆凝胶可促进移植脂肪组织局部的血管再生,增加脂肪组织的质量保持率,减少脂肪移植后的纤维坏死程度。

异体骨髓间充质干细胞联合自体PRP促进皮肤慢性溃疡创面愈合的实验研究

目的探讨在皮肤慢性溃疡处注射异体骨髓间充质干细胞（BMSC）和自体富血小板血浆（PRP）对皮肤的再生和重建的作用。方法选择健康6—8周龄SD大鼠17只，取其中1只大鼠，采用全骨髓法体外分离培养BMSC，取传至第3代细胞，移植前48h行DiI荧光标记。剩余16只大鼠麻醉后制作全层皮肤缺损模型，于其背部脊柱两侧制作4个全层皮肤缺损创面并随机分为4组。A组局部注射异体BMSC悬液联合PRP治疗，B组局部单纯注射异体BMSC悬液，C组局部单纯注射PRP治疗，D组局部注射等量生理盐水。治疗7、14d采集标本观察结果。采用大体观察、苏木素一伊红染色、荧光显微镜观察创面愈合情况。结果体外分离培养的BMSC具有成脂、成骨、成神经分化潜能。在治疗后7、14d，A、B、C组创面愈合时间均短于D组，A组愈合时间比B、C组缩短。组织学观察发现A组新生真皮相应时间点的厚度、血管和胶原纤维均明显多于其他3组。结论在皮肤慢性溃疡处联合应用异体BMSC和自体PRP，能加速真皮的修复和重建。

新型聚乳酸/骨基质多孔复合支架材料制备及初步研究

目的采用CO2超临界法(SC-CO2)制备一种新型的聚乳酸(PLA)/骨基质(BMG)多孔复合型生物活性骨支架材料,并评价其理化性能及细胞相容性,确定材料最佳复合比例,为进一步的实验提供实验依据。方法采用SC-CO2法制备不同比例的PLA/BMG多孔复合型骨植入材料,通过大体观察、孔隙率测定,力学检测、SEM观察评价其理化性能,并结合体外细胞相容性检测选择最佳复合比例。结果采用SC-CO2法制备的PLA/BMG多孔复合支架材料中BMG的比例与材料的孔隙率及细胞相容性成正相关,与力学性能成负相关;含30%BMG的复合材料具有良好的综合性能。结论采用SC-CO2法制备的PLA/BMG(7/3)多孔复合支架材料具有良好的理化性能及细胞相容性,可作为骨植入材料及骨组织工程支架进一步研究。

缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞与自体脂肪移植

背景:自体颗粒脂肪组织作为理想的填充材料用于美容与重建修复领域,但因其移植后组织大量被吸收,严重影响了远期效果。目的:观察缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞对自体移植脂肪组织存活率的影响。方法:取健康成年人吸脂术后的脂肪组织分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,传至第3代,调整细胞浓度为1×109L-1,经缺氧诱导因子1α基因转染后调整细胞浓度为1×1011L-1备移植时使用;同时选用同一抽脂术后的脂肪组织颗粒并进行纯化,利用纤维蛋白胶的物理特性制备不同成分脂肪组织复合移植物,在20只裸鼠背部皮下随机分离3个腔隙,实验分为3组:基因修饰组移植经缺氧诱导因子1α基因修饰的脂肪干细胞+脂肪组织+纤维蛋白胶;基因未修饰组移植单纯脂肪干细胞+脂肪组织+纤维蛋白;生理盐水组移植生理盐水+脂肪组织+纤维蛋白。结果与结论:移植后3个月和6个月,各组移植物血管密度比较,基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组,组间比较差异有显著性意义(P<0.05);各组移植物脂肪细胞纤维坏死率比较,基因修饰组<基因未修饰组<生理盐水组,组间比较差异有显著性意义(P<0.05);各组移植物脂肪质量保持率比较,基因修饰组>基因未修饰组>生理盐水组,组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。结果证实,缺氧诱导因子1α基因转染脂肪干细胞可促进移植脂肪组织局部的血管再生,促进脂肪细胞的成活,增加脂肪组织的质量保持率,减少脂肪移植术后的纤维坏死程度。

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨能力的影响。方法取大鼠骨髓组织,密度梯度离心法体外分离培养BMSCs。取第3代细胞接种,分别加入含0.5%、1%、2%、5%、10%PRP的成骨诱导液或DMEM培养基进行培养,并以加入不含PRP的成骨诱导液或DMEM培养基培养(0 PRP)的BMSCs作对照。采用XTT比色法测定BMSCs的增殖情况。分别于培养3、7、11 d时用ELISA法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,培养7、14、21 d时用放射免疫法检测骨钙素(OCN)表达量,培养21 d时用茜素红染色观察钙化结节形成能力。结果成骨诱导培养的前7 d,PRP可促进BMSCs增殖,成骨诱导培养7 d以后,PRP也可促进BMSCs的成骨分化,且随着PRP浓度的增加,促细胞增殖、分化和成骨能力逐渐增强。PRP促进BMSCs内ALP活性和OCN表达的作用也呈剂量依赖性。成骨诱导培养21 d后,5%、10%的PRP诱导钙化结节形成能力优于0.5%、1%和2%的RPR,0 PRP培养的BMSC仅见少量钙化结节形成。结论在体外成骨诱导培养条件下,RPR能有效促进BMSCs的生长增殖和成骨分化,以浓度10%为最佳。

荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化

背景:目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键。目的:观察经荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料:SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。DiI应用液为美国Molecular ProbeInc公司产品。方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的DiI应用液5μL,37℃下孵育25min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化。另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化。主要观察指标:DiI标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力。结果:锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下DiI标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与未标记细胞比较,DiI标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化(P>0.05)。成骨诱导7d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变。结论:DiI能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,DiI标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力。

多孔聚乳酸/骨基质明胶生物活性复合材料骨诱导活性实验(英文)

背景: 目前复合材料已成为骨移植材料研究的热点, 多孔聚乳酸 /骨基质明胶复合活性材料的应用有待研究。目的: 采用超临界二氧化碳合成法制备多孔聚乳酸 / 骨基质明胶复合活性材料, 体外评价其骨形成能力。设计: 观察对比实验。单位: 南方医科大学组织工程研究中心, 中国辐射防护研究院生物材料制药技术研究所。材料: 小鼠 MC3T3-E1 成骨前体细胞从日本 RIKEN 细胞库获得, 聚乳酸由暨南大学提供。碱性磷酸酶检测试剂为南京建成生物工程研究所产品。小鼠 MC3T3-E1 成骨前体细胞在含 100 g/L 胎牛血清 ( 四季青) 、100 mg/L 青霉素和 100 U/L 链霉素的 DMEM 培养基(Gibco, 美国) 培养, 用 0.25%胰酶(Gibco, 美国) 传代。方法: 实验于 2005- 10/2006- 07 在南方医科大学组织工程研究中心广东省重点实验室完成。采用超临界二氧化碳法制备多孔聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料, 并通过大体及扫描电镜观察复合情况。在体外将聚乳酸、聚乳酸 / 骨基质明胶与 MC3T3-E1 小鼠成骨前体细胞共培养, 分别为聚乳酸组及聚乳酸 / 骨基质明胶组, 正常培养基作为对照组, 数码相机拍摄每组培养孔图像, 图像处理与分析软件测定被染色面积占培养孔面积百分比, 即为钙化结节面积百分比。采用细胞超声裂解法检测各组细胞内钙含量及碱性磷酸酶活性。主要观察指标: ①聚乳酸 / 骨基质明胶大体及扫描电镜观察结果; ②钙化面积的定量测定。③钙含量及碱性磷酸酶活性测定。结果: ①聚乳酸 / 骨基质明胶大体及扫描电镜观察结果: 复合材料骨基质明胶与聚乳酸混合均匀, 材料孔隙分布均匀, 孔隙大小在 50～150 μm之间, 孔洞联通性好。在这些大孔隙的壁上, 仍有大量 5～10 μm 的孔隙。②钙化结节面积测定结果: 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组、聚乳酸组、空白对照组钙化结节形成面积百分比分别为 (42.98±4.44)%,(9.55±1.94)%, (0.86±0.41)%, 组间比较差异均有统计学意义 (P <0.01) 。③钙含量及碱性磷酸酶测定结果: 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组、聚乳酸组和空白对照组的碱性磷酸酶活性分别为 (5 427.58±1 173.57), (1 060.54±500.27), (40.01±24.50) nkat/g, 组间比较均有统计学意义(P < 0.05～0.01) ; 聚乳酸 / 骨基质明胶复合材料组钙含量为(3.51±1.64)mmol/g, 高于聚乳酸组和空白对照组[(1.04±0.21) , (0.70±0.24)mmol/g, P < 0.01]。结论: 采用超临界二氧化碳合成法制备的聚乳酸 /骨基质明胶多孔复合支架材料具有良好的骨诱导活性, 有可能作为一种有前景的骨植入材料及骨组织工程支架材料。

复合庆大霉素羊同种抗菌骨抗感染及成骨实验

目的:研制一种既有成骨作用又有局部抗感染能力,且有较低免疫原性的新型高效骨植入材料。方法:实验于2002-09/2005-03在中国辐射防护研究院动物实验中心完成,采用超声负压双重复合法制备庆大霉素含量为172mg/条的复合羊同种抗菌骨,植入羊股(肱)骨骨缺损合并感染模型绵羊5只(实验组),对照组5只植入空白骨,采用大体观察、白细胞计数、影像学、组织学、细菌学检查等指标评价其抗感染效果及成骨能力。结果:参加实验10只绵羊,对照组1只羊于第17天死于金黄色葡萄球菌所致败血症。进入结果分析为9只绵羊。①实验组除1例感染外,其余有效的控制了感染并有新骨形成。②对照组术后第4,6周植入骨被脓液包裹,第8,10周植骨区基本被纤维组织填充。③成骨组织及炎性组织体积密度上差异均存在统计学意义(P<0.01),说明实验组比对照组有较多的新骨形成与较轻微的炎性反应。④实验组与对照组在骨组织细菌密度差异有显著性意义[(1.64±3.37)×108,(1.64±3.27)×1012CFU/g,P<0.05]。说明庆大霉素复合抗菌骨能有效抑制局部细菌的生长繁殖。结论:复合庆大霉素同种抗菌骨具有较好的局部抗感染效果及成骨能力。

大鼠骨髓基质干细胞定向分化为成骨细胞及体外增殖过程中地塞米松的抑制性干预

目的:地塞米松在体外诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中起着关键性作用。验证骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的能力,观察成骨细胞分化早期地塞米松对骨髓基质干细胞体外增殖的抑制效果。方法:实验于2006-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。①实验方法:取5周龄雄性SD大鼠10只,经颈椎脱位法处死后取股骨,去除双侧干骺端,用DMEM高糖完全培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,离心后按(1～2)×107L-1密度接种,加入条件培养液(DMEM高糖完全培养基,体积分数为0.1的标准胎牛血清,50mg/L维生素C,10mmol/L的B-甘油磷酸钠,100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)进行体外培养。分别于细胞传代培养后第0,2,4天向培养基中加入1μmol/L地塞米松1mL,并设立仅加入等量培养基的空白对照组。②实验评估:以2d为间隔,倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用CellTiter96试剂盒各组细胞增殖情况。结果:①骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化:原代培养中贴壁细胞多呈长梭形,少数呈小圆形或三角形。原代培养六七天后进行传代,多数细胞在加入地塞米松后逐渐呈均一的长梭形,随着时间延长呈叠形多层排列,细胞外基质明显增多,并逐渐形成多个小结样结构。空白对照组细胞形态欠均一,少数细胞呈多边形或三角形,细胞外基质明显少于地寒米松组,罕见小结样结构。传代后10～12d可达80%～90%致密层,细胞生长速度较原代细胞明显增快,至第10代细胞仍未出现衰老现象。②骨髓基质干细胞的增殖检测:与空白对照组比较,细胞传代培养后第0,2,4天加入地塞米松,干预处理8,10,12d时的细胞数量均明显下降(t=5.0445～11.3795,P均<0.01)。结论:①传代的骨髓基质干细胞经地塞米松处理后,细胞形态趋于成熟,生长速度加快,可定向分化为成骨细胞。②在向成骨细胞分化早期,地塞米松能够抑制骨髓基质干细胞的体外增殖。

自体PRP促进人脂肪来源干细胞成骨分化的体外实验研究

目的探讨自体PRP对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成骨分化的影响。方法取自愿捐献吸脂术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs,倒置显微镜下观察细胞生长情况。将第3代ADSCs分别行成脂、成软骨定向诱导培养鉴定,并行CD29及CD44免疫荧光染色观察。取第3代ADSCs分别采用含10mL/LPRP的成骨诱导培养基(PRP组)和不含PRP的成骨诱导培养基(对照组)进行培养,倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5d采用MTT法检测细胞增殖活性;7、14、21、28d行ALP活性检测,另取培养7、14d的PRP组细胞行ALP染色观察;14d时行PRP组茜素红染色检测钙结节形成情况。结果倒置显微镜下第3代ADSCs多为梭形,倍增时间约35h。成脂及成软骨诱导鉴定均为阳性,免疫荧光染色CD29和CD44呈阳性。MTT法示PRP组1、2、3、4、5d的吸光度值分别为0.137±0.015、0.219±0.023、0.367±0.031、0.586±0.039、0.948±0.046,对照组分别为0.081±0.009、0.115±0.012、0.162±0.017、0.242±0.025、0.356±0.032,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。成骨诱导7d后,PRP组ALP染色阳性,细胞胞浆呈灰黑色,可见黑色沉淀;14d后阳性细胞增多。ALP活性检测示PRP组7、14、21、28d细胞活性值分别为23.96±2.05、41.26±3.38、38.12±3.03、35.89±2.24,对照组分别为17.83±1.62、26.64±2.37、23.85±1.99、20.78±1.81,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。成骨诱导14d后,茜素红染色示PRP组钙结节形成。结论体外培养时,自体PRP可促进人ADSCs的增殖并诱导成骨分化,为骨组织工程提供一种新的种子细胞来源。

免疫抑制剂FK506对雪旺细胞的影响

周围神经损伤后,雪旺细胞对周围神经再生过程中的形态和功能的修复起着至关重要的作用。其增殖速度的提高可大大改善神经移植桥接体的存活率,但免疫排斥反应仍是影响异体组织工程化神经移植成败的关键所在。迄今为止,已经有很多免疫抑制剂应用于临床。免疫抑制剂FK506能有效地抑制周围神经同种异体和异种移植中的排斥反应。本综述从免疫抑制剂FK506的理化性质和作用机制及其对雪旺细胞增殖的影响因素入手,阐述免疫抑制剂FK506对雪旺细胞的增殖作用,为FK506进一步的深入研究和临床应用提供理论依据。