FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用

目的:探讨优化现有荧光原位杂交(FISH)技术用于产前诊断唐氏综合征及其单细胞植入前遗传学诊断(PGD)的临床应用价值。方法:应用21号和X染色体特异性荧光素标记的双色混合探针对正常人体标本和25例唐氏综合征患儿外周血以及10例血清筛查阳性孕妇羊水进行FISH分析,同步进行羊水细胞培养,行常规细胞染色体核型分析,并以核型分析结果为金标准,建立一套稳定的FISH方法。在常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术方法基础上,用该方法分别对13例未受精卵、卵裂球进行唐氏综合征遗传学诊断。结果:正常羊水间期细胞和拟诊唐氏综合征羊水间期细胞经FISH分析,结果与染色体核型分析的结果一致,符合率100%。结论:建立的FISH方法具有快速、简便、准确性高、特异性强的特点,是快速进行产前唐氏综合征筛查及扩大PGD技术应用的简易可靠技术,有很好的临床应用价值。

单纯男性因素不育患者行形态选择性卵胞浆内单精子注射对胚胎发育及临床结局的影响

目的使用放大系统对不育男性患者的精子进行形态选择性卵母细胞浆内单精子注射术（IMSI）,观察IMSI技术能否改善因男性精液问题而不孕不育夫妇的助孕结局。方法回顾分析本中心2013年1月-2014年11月共82例梗阻性无精子症患者,将行TESA（经皮睾丸穿刺抽吸精子术）获得的睾丸精子通过放大系统（×6600）挑选后行卵母细胞注射（IMSI组）,2013年1月-2014年11月共91例梗阻性无精子症患者经TESA取精术后行常规卵母细胞浆内单精子注射（ICSI组）;2014年1月-11月共44例畸精子症患者行形态选择性包浆内单精子注射治疗（IMSI组）,2014年1月-11月共71例畸精子症患者行常规ICSI治疗（ICSI组）。统计分析ICSI组和IMSI组患者的实验室结局和临床结局。结果梗阻性无精子症患者中正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（84.3%vs 77.0%）（P〈0.05）;ICSI组的卵裂率95.5%,优胚率28.2%,囊胚形成率54.8%,种植率26.4%,临床妊娠率47.3%,流产率14%,梗阻性无精子症IMSI组患者的卵裂率96.7%,优胚率29.2%,囊胚形成率54.3%,种植率32.3%,临床妊娠率50.0%,流产率7.3%,两组无显著性差异（P〉0.05）。畸精子症患者的正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（68%vs 75.5%）（P〈0.05）,囊胚形成率IMSI组显著高于ICSI组（54.6%vs 67.9%）（P〈0.05）,ICSI组的卵裂率96.2%,优胚率27.6%,种植率28.2%,临床妊娠率43.7%,流产率9.7%;IMSI组患者的卵裂率95.2%,优胚率27.1%,种植率30.7%,临床妊娠率43.2%,流产率10.5%,两组无显著性差异（P〉0.05）。结论梗阻性无精子症患者的睾丸精子经放大系统选择后行ICSI,正常受精率较传统ICSI有显著性提高;畸精子症患者射出的精液标本经放大系统挑选后行ICSI,正常受精率、囊胚形成率较传统ICSI有显著性提高。

杆状病毒转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞

杆状病毒作为一种新型基因载体,若能有效转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived mesen-chymal stem cells,BMSCs),将会成为干细胞基因修饰研究领域中更理想的一种基因载体。本文探讨了重组杆状病毒(BacV-CMV-EGFP)对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。体外原代培养小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs。用培养3代以上的哺乳动物BMSCs进行病毒转导实验,转导2d后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同哺乳动物BMSCs中的表达,并用流式细胞仪检测重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。结果显示:原代培养的小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs于体外传代3次以上后,细胞呈现较均一的梭形,漩涡状生长;倒置荧光显微镜观察显示,与小鼠、大鼠、猪的BMSCs相比,恒河猴及人有更多BMSCs表达绿色荧光蛋白,且荧光强度较强;杆状病毒对小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs的转导效率分别为(21.21±3.02)%﹑(22.51±4.48)%﹑(39.13±5.79)%﹑(71.16±5.36)%及(70.67±3.74)%。上述结果表明,重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率不同,对恒河猴及人的BMSCs转导效率较高,说明重组杆状病毒可作为人或灵长类动物BMSCs基因修饰研究领域中更理想的基因载体。

多重荧光定量PCR技术快速诊断唐氏综合征方法的建立及临床应用

目的:建立适合中国广东地区人群特点的唐氏综合征快速产前诊断技术,并评价其临床应用价值。方法:选取21号染色体上杂合度较高的3个短串联重复序列(STR,D21S1411、D21S1412、D21S1270)作为遗传标记,采用多重荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)扩增技术,对广东地区106例无亲缘关系的正常人外周血DNA进行分析,计算这3个STR位标的多态性信息含量(PIC);用该方法对25例唐氏综合征患儿外周血和10例正常孕妇羊水的DNA进行检测,并与染色体核型分析结果进行对照分析。结果:21号染色体上的3个STR(D21S1411、D21S1412、D21S1270)的PIC分别为0.913、0.835、0.856,确立了QF-PCR产前诊断唐氏综合征的方法。对25例唐氏综合征患儿外周血和10例孕妇羊水同时进行QF-PCR检测与染色体核型分析,两种方法均检测到27例唐氏综合征,结果吻合。结论:本研究所选STR位标在中国广东人群中呈现较高的遗传多态性,符合Hardy-W e inberg平衡定律;所构建的QF-PCR技术产前诊断唐氏综合征具有准确、快速、高效等特点,有较高的临床使用价值。

一种新的斑马鱼cloche突变体亚型的基因鉴定

目的斑马鱼cloche172突变体的基因鉴定。方法采用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱变雄性野生型AB斑马鱼,实施大规模正向遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozymeC(lyC)表达缺失突变体,并对其中一个名为cloche172突变体进行大体形态学观察,基因定位克隆和遗传学互补实验。结果大规模正向遗传学筛选出4个lyc表达缺失突变体,其中一个cloche172突变体受精后3d(day post fertilization,dpf)时期大体形态改变与已知但基因不明的cloche突变体相似。遗传学互补实验观察到有1/4胚胎出现类似cloche突变体的表型。同时,cloche172突变体基因定位在13号染色体近端粒的区域,与cloche突变体基因定位区域一致。而o-dianisdine实验证实cloche172突变体有较多红细胞聚集,cloche突变体仅有少量在尾部存在。结论cloche172基因与cloche基因定位一致,cloche172突变体是一个新的点突变位点的cloche突变体。

不同基因载体转导人骨髓间充质干细胞比较

目的比较腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的转导效率。方法体外原代培养hBMSCs,进行腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体转染实验。采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测经基因载体转染后的hBMSCs胞内目的蛋白表达情况。结果倒置荧光显微镜观察结果显示,基因载体转染后的部分hBMSCs胞内有GFP表达而发绿色荧光,其中杆状病毒转导的hBMSCs荧光强度较强。流式细胞仪检测结果表明,腺病毒载体、腺相关病毒载体及质粒载体的转导效率和绿色荧光蛋白阳性细胞平均荧光强度分别是42%、37%、22%和158、115、77,均明显低于杆状病毒的70%(P<0.01)和212(P<0.05)。结论杆状病毒载体对hBMSCs的转导效率高于腺病毒载体、腺相关病毒载体和质粒载体,有望成为人体基因治疗研究中更为理想的基因载体。

早发性家族性阿尔茨海默病家系的临床表型及基因突变分析

【目的】对一个早发性家族性阿尔茨海默病家系(EOFAD)进行全外显子组测序,寻找可能引起致病的突变位点,为遗传咨询和产前诊断提供参考。【方法】对该家系成员进行全外显子基因检测,随后运用Poly?Phen-2和SIFT等生物信息学软件进行突变基因有害性预测。【结果】测序结果显示家系中患者在TTC3基因的第9个外显子发生c.758A>G突变,导致所编码的TTC3蛋白的第253位氨基酸由原来的酪氨酸变为半胱氨酸(p.Tyr253Cys)。根据家系共分离及相关生物信息学分析得出该突变基因为可能致病的变异。【结论】TTC3基因第9个外显子c.758A>G突变为该EOFAD家系可能致病的原因,该突变为首次发现报道。本结果扩展了TTC3基因突变谱,为家系遗传咨询提供了依据。

阴沟肠杆菌耐药性分析及NDM-1基因检测

目的探讨阴沟肠杆菌的耐药性以及对亚胺培南耐药菌株进行新德里金属β-内酰胺酶1型(NDM-1)基因检测分析,为临床治疗阴沟肠杆菌感染合理用药提供试验依据。方法试验菌株分离自2011年7月-2012年6月的临床标本,采用西门子Microscan Walkway 40plus全自动微生物分析系统对菌株进行鉴定及药敏检测,应用WHONET5.4对数据进行分析统计;聚合酶链反应(PCR)特异性扩增NDM-1基因,并对扩增产物进行测序和BLAST分析。结果共分离得到35株阴沟肠杆菌,对亚胺培南敏感性最高,敏感率为91.4%,但也出现3株耐药菌株,其次为阿米卡星;对第一代头孢菌素头孢唑林及广谱青霉素的耐药率>90.0%,对其他抗菌药耐药率>40.0%;3株亚胺培南耐药菌株NDM-1检测均为阳性,且同源性为100.0%。结论多药耐药阴沟肠杆菌及产NDM-1阴沟肠杆菌的出现,造成耐药形势日益严峻,需要加强监测力度。

人类精子空泡及中心体形态对ICSI患者胚胎发育的影响

目的利用精子放大系统将精子放大6000倍后，观察精子是否含空泡及精子中段形态，探讨精子空泡及中心体形态对行卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）患者的胚胎发育的影响。方法57例来自成都锦江生殖中心因男方因素行ICSI患者，常规挑选完形态正常的精子（×200-×400）后，再次利用精子放大系统对精子有无空泡和精子中段形态进行观察。根据精子中段形态将精子分为三类，A类：1≤a／b≤1．2；B类：a／b≥1．5；C类：其他不规则形态。有无空泡和精子中段组分为：空泡．A，空泡．B，空泡．C，无空泡．A，无空泡-B，无空泡-C。随后按照常规ICSI注射后培养，并观察胚胎发育情况和患者临床结局。结果空泡．A、B、C3组在2PN率、D3优胚率、可用囊胚率及胚胎冷冻率上均无显著性差异（P〉0．05）；无空泡-A，B，CZ组的可用囊胚率上无显著性差异（P〉0．05），而2PN率（74．48％VS84．62％VS57．14％），卵裂率（96．17％VS97．06％VS80．95％），D3优胚率（35．48％VS39．39％vs9．09％）、D6囊胚形成率（21．05％VS34．78％VS0），胚胎冷冻率（31．25％VS26．92％VS0）均有显著性差异（P〈0．05）。另外A组中有无空泡中，仅仅胚胎冷冻率上具有显著性差异（P〈0．05），B组中2PN率具有显著性差异性（P〈0．05），C组中可用囊胚率和胚胎冷冻率具有显著性差异（P〈0．05），3组中其余指标均无显著性差异（P〉0．0）。结论精子头部无空泡和中心体形态较好的精子注射入卵后，能提高2PN率、D3优胚率、胚胎冷冻率。由于样本量较少，仍然需要较大的样本量来进一步证实，为精子空泡以及中心体对胚胎发育影响的相关研究提供参考。

双相Ⅰ型障碍患者躁狂发作期血清HTR1A基因启动子区甲基化水平的研究

目的探讨双相障碍Ⅰ型患者在躁狂发作时的血清5-羟色胺1A受体(5-hydroxytryptamine receptor 1A,HTR1A)基因启动子区甲基化水平。方法随机收集56例双相障碍Ⅰ型患者处于躁狂时相的血清,采用焦磷酸测序技术检测HTR1A基因启动子区甲基化水平,与59例正常对照组进行对比。Pearson相关分析双相障碍Ⅰ型患者躁狂时相BRMS评分与HTR1A 5-甲基化率的相关性。结果双相障碍Ⅰ型患者躁狂发作时HTR1A基因启动子区甲基化水平[(66.55±10.55)%]高于正常对照组[(54.03±8.85)%](t=6.909,P<0.01)。Pearson相关分析显示双相躁狂BRMS得分与其甲基化率呈正相关(r=0.534,P<0.01)。结论HTR1A基因启动子区甲基化水平与双相障碍躁狂发作密切相关,将来可能为临床诊断提供实验室依据。

抑郁发作期双相障碍患者外周血5-HTR1A启动子区甲基化水平与抑郁发作的相关性

目的探讨处于抑郁发作期的双相障碍患者外周血细胞五羟色胺1A受体基因(5-HTR1A)启动子区甲基化水平以及与抑郁症状的关系。方法收集2017年8月至2019年8月来自广东省精神卫生中心、中山市第三人民医院和江门市第三人民医院的65例处于抑郁发作期的双相障碍患者(研究组)和59名健康人(对照组)的外周血,对2组血细胞5-HTR1A启动子区甲基化水平使用焦磷酸测序技术进行检测,采用t检验进行对比。研究组同时进行汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分,采用Pearson相关分析对甲基化水平与量表评分之间的相关性进行分析。结果抑郁发作期的双相障碍患者外周血细胞5-HTR1A启动子区甲基化水平低于对照组[(46.86±6.75)%vs (50.03±8.85)%],差异具有统计学意义(t=2.255,P=0.013)。Pearson相关分析显示研究组HAMD评分与其甲基化率呈负相关(r=-0.631,P <0.01)。结论抑郁发作期的双相障碍患者外周血的5-HTR1A启动子区甲基化水平与抑郁发作之间可能存在相关性。