荧光活性染料DiI标记人脂肪干细胞

目的:观察荧光活性染料DiI标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法。方法:实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成。取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎。0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM+双抗完全培养基中和后,1300r/min离心5min,去上清液,沉淀混悬后150UM尼龙网过滤,按1×104～2×104接种于25cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3d换液。待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用。将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109L-1密度加入5μLDiI应用液,37℃下孵育20min,1500r/min离心5min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72h脂肪干细胞显色情况及形态变化。检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况。结果:①DiI标记脂肪干细胞体外观察:台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%。DiI标记后早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况:未标记DiI的脂肪干细胞与标记DiI的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P>0.05)。结论:①DiI能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达。②DiI标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性。

利用抑制消减杂交筛选瘢痕疙瘩差异表达基因

目的利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技术,比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织之间基因表达差异,筛选瘢痕疙瘩特有的差异表达基因片段,为揭示瘢痕疙瘩的病因提供实验依据。方法提取瘢痕疙瘩与正常皮肤组织细胞mRNA,逆转录成cDNA。以瘢痕疙瘩cDNA为检测子,正常皮肤组织细胞cDNA为驱动子,选择四碱基内切酶Rsa将cDNA酶切;连接特殊设计的接头进行消减杂交和PCR反应,得到消减混合物,与T载体连接,转化DH5α感受态细菌,建立差异消减文库。Southern杂交筛选鉴定差异基因,进行测序和同源分析。结果经SSH筛选、Southern杂交鉴定得到13个瘢痕疙瘩差异表达基因,其中已知功能的基因11个,如TA结合因子1、E4基因转录因子1、ephrinB2型受体基因、血小板生长因子受体基因等;有与肿瘤发生有关的基因,如G抗原7基因等;未知功能基因2个。结论筛选得到的瘢痕疙瘩差异表达基因,对了解瘢痕疙瘩发生发展的病因学基础和指导临床治疗具有重要意义。

瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴母细胞系的建立方法及意义

目的:探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法,为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源.方法:采用CysA法、微量全血法和冻存全血法3种不同方法建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL),比较各方法建系成功率及时间.结果:成功建立了一瘢痕疙瘩家系的永生细胞株,其中CysA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为96.4%,46.4%,28.6%;建立细胞系平均所需时间分别为28.8d,39.7d,46.3d.结论:CysA法成功率高,建系所需时间短,是建立B-LCL最可靠的选择.

成人外周血单个核细胞体外培养过程中分化为早及晚期内皮祖细胞生物学表征

目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化。方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成。①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意。②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3d换液一次。③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查。结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长。培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞。至第3周鹅卵石样细胞已占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失。②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达。免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致。结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞。二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同。晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源。

瘢痕疙瘩易感基因的家系连锁分析定位研究

目的:探讨瘢痕疙瘩(keloid)家系中易感基因与15q22.31￣q23及18q21.1区域的连锁关系。方法:1个中国东北地区4代瘢痕疙瘩家系,采集家系中32名成员的外周血标本提取DNA,选择位于15q22.31￣q23及18q21.1区域7个微卫星标记,应用聚合酶链式反应(PCR)得到扩增产物片断,测定PCR产物片段大小,得到每个样本的基因型。运用连锁分析软件LINKAGE的MLINK程序计算每个标记的LOD值,根据两点间LOD值判断连锁关系。结果:D15S108、D15S216、D15S534、D18S363、D18S846五个位点的两点LOD值在重组率为0时均小于-2,可以排除此家系疾病候选基因与上述位点的连锁关系,而D18S460、D18S467两位点在重组率为0.05和0.10时的两点LOD值均大于1,且外显率为90%的条件下,D18S460在θ=0时LOD值大于2,提示此家系瘢痕疙瘩易感基因与这两个位点存在一定的连锁关系。结论:此瘢痕疙瘩家系的易感基因可能位于18q21.1区域内。

足背皮瓣与足外侧或外踝上哑铃状联合皮瓣设计的解剖基础

目的:为手部复杂外伤并两处皮肤缺损及深部组织损伤外露的修复提供理想的皮瓣供区。方法:40侧动脉灌注红色乳胶的成人下肢标本,解剖观测胫前血管、腓血管穿支降支在踝前的分支、分布、外径及其远端吻合情况。结果:胫前动脉在踝间或踝上向外侧恒定地发出外踝前动脉。根据胫前动脉外踝前支的分出位置、粗细及与腓动脉穿支降支的吻合情况,可将其分成以下四型。两主干血管吻合后下行经外踝前至足背外侧与跗外侧动脉吻合,沿途发出皮支营养胫前踝上和足背外侧。结论:可以在形成以胫前血管为蒂的足背皮瓣同时,以胫前血管的外踝前动脉为血供设计足外侧或外踝上联合皮瓣应用。

脂肪来源细胞和透明质酸钠复合物构建裸鼠皮下软组织

目的探讨脂肪来源细胞(ADCs)作为新型真皮充填物的可能性。方法ADCs取自3例行整复手术的男性患者的残余脂肪组织,支架材料为透明质酸钠。实验分为三组,实验组:ADCs(25×106/mL)与透明质酸钠混合,每一样本0.2mL注射于雌性BLAB/c裸鼠皮下;对照组1:单纯运用透明质酸钠,每一样本0.2mL注射于裸鼠皮下;对照组2:单纯运用ADCs(25×106/mL),每一样本0.2mL注射于裸鼠皮下。8周后取材,通过大体和组织学观察,以及性染色体RT-PCR检测,对再生组织进行评价。结果实验组形成软组织呈球形,平均体积(0.0352±0.0115)mL;组织学观察显示,生物材料完全降解,组织排列紊乱,间有大量排列紊乱的胶原纤维,无脂肪组织;两对照组均无任何组织形成。结论应用组织工程技术,以人脂肪来源细胞为种子细胞,透明质酸钠为支架材料,能构建出良好的组织工程化软组织;为探索一种安全、有效的除皱方法,提供了新的研究方向。

磷脂酰胆碱注射溶脂初探

目的:观察磷脂酰胆碱注射溶脂的有效性和安全性。方法:5%磷脂酰胆碱注射液0.08ml(4mg)/cm2分别在SD大鼠脂肪内、皮内、肌肉内局部注射共三次,给予大体观察、组织学检查及毒副作用检测。结果:磷脂酰胆碱对皮下脂肪有明显的破坏作用,对皮肤及肌肉组织也有损坏,未见全身毒副反应。结论:磷脂酰胆碱皮下注射有明显的溶脂效果,但其对组织的损坏为非特异性。

分离与培养人脂肪组织间充质干细胞的研究

目的:探索人脂肪组织源性间充质干细胞(ASCs)的分离、体外培养,为其广泛应用提供实验依据。方法:无菌条件下获取腹部手术病人皮下脂肪组织,酶消化法分离、培养ASCs,观察细胞形态并绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间;对第2代细胞进行免疫组织化学染色,鉴定其表面分子CD44表达;取2-4代细胞用含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素原液、1μmmol/L地塞米松1、0μmmol/L胰岛素、0.5mmmol/LIBMX的高糖DMEM培养基中诱导培养一周,观察细胞形态变化,并用油红“O”染色定性。结果:人脂肪组织中含有大量间充质干细胞,呈成纤维细胞样贴壁生长,细胞群体倍增时间为55h左右;免疫化学染色鉴定CD44阳性;成脂诱导分化一周,可见细胞内有大量脂滴,油红“0”染色可见胞浆内有大量红染颗粒。结论:建立了一种自人体脂肪组织分离,培养ASCs经济简便的方法,为其能够作为组织工程理想的种子细胞及广泛应用于临床提供实验依据。

b-FGF和TGF-β1对体外培养的软骨细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的软骨细胞增殖的影响。方法:细胞取自猪耳弹性软骨,体外培养原代至第6代软骨细胞,将培养液中加入TGF-β1或/和b-FGF作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨两种因子对软骨细胞增殖行为的影响。结果:b-FGF明显促进原代至第3代软骨细胞的增殖,并逐渐减弱,对第4代细胞无增殖作用,TGF-β1仅促进原代软骨细胞的增殖,TGF-β1和b-FGF联合应用,其刺激细胞增殖的作用明显低于b-FGF单一作用。结论:b-FGF显著促进体外培养的软骨细胞的增殖,主要作用于原代至第2代软骨细胞,明显强于b-FGF和TGF-β1联合应用。

TGF-β对毛囊生长发育影响的研究进展

转化生长因子-β(TGF-β)属于TGF-β超家族,在毛囊发育过程中,TGF-β1、TGF-β2及其受体在毛囊中的表达具有部位和毛发生长周期的特异性,且有多种信号途径参与TGF-β对毛囊生长发育的调控,TGF-β转基因或基因敲除鼠的研究也证实TGF-β相关信号是毛囊发育所必需的。表明TGF-β在毛囊发生发育和周期性循环中起到十分重要的作用。本文就TGF-β在毛囊发育和生长周期中的作用进行综述。

浅谈研究生就业教育问题

结合工作实际,分析了研究生走上工作岗位后面临的问题,以及问题出现的原因,说明了就业教育的重要性,探讨了从德育工作、心理引导、道德启发、人际沟通能力培养等方面加强就业前教育的有效举措,旨在对研究生就业指导工作有所裨益。

八年制医学教育人才培养研究

八年制医学教育是一种"精英"医学人才培养模式,需要建立一套与之相适应的人才培养体系,构建合理的课程体系,采用科学的临床教学方法,探索适宜的临床科研训练模式,建立多元评价体系,培养具有国际竞争力的高素质医学人才。

瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒的临床应用

目的:在浙江地区对瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒进行临床实验,评价此试剂盒的准确度和有效性。方法:采用聚合酶链反应-反向点杂交方法建立的试剂盒检测了浙江地区75例瘢痕疙瘩患者与75例正常对照的p53基因第72位密码子多态性位点的基因型。结果:瘢痕疙瘩组的Pro等位基因及Pro/Pro基因型频率明显高于对照组(P值分别为0.014、0.015),Pro/Pro基因型者患瘢痕疙瘩的风险性明显增高(OR=2.404,95%CI:1.182～4.887)。结论:p53基因检测试剂盒可以预测瘢痕疙瘩高危个体,对于临床诊断和治疗方面也有一定的指导意义,并具有良好的可重复性和特异性。

宿主因素对毛囊重建影响的实验研究

目的:研究宿主因素对毛囊重建的影响即探讨不同种系小鼠(免疫功能缺陷及正常小鼠)作为宿主时毛发再生情况。方法:将GFP新生鼠的表皮、真皮单细胞以一定比例注射到C57和裸鼠体内。诱导形成异位毛发,并于移植后2、4、7、14、18、21 d取材进行观察,随后每隔3 d取材,直至观察到所形成毛发重新进入生长期。结果:两种小鼠体内均可形成新的毛囊,新生毛囊在诱导阶段大致相同。但C57鼠新生毛囊在18 d进入退行期,而裸鼠在21 d。C57鼠新生毛囊在33 d重新进入生长期,裸鼠则在39 d。HE切片见再生毛囊结构完整,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光。细胞以不同的比例移植后发现,C57鼠体内毛囊重建效率高于裸鼠,且二者的真表皮细胞的最佳比例不同,单一细胞移植至两种鼠体内时均无毛发形成。结论:新生鼠真表皮细胞注射到不同种系小鼠体内均能形成新的毛囊,不局限于免疫功能缺陷宿主,但宿主因素对毛囊重建也会造成一定影响,所形成毛囊的周期、毛囊重建效率及形成的毛发性状不同。

人脂肪来源干细胞复合Ⅰ型胶原支架构建工程化脂肪组织的实验研究

目的探讨构建组织工程化脂肪组织的可行性，为临床修复软组织缺损寻找一种新方法。方法以酶消化法从人脂肪抽吸术抽吸物脂质部分获取人脂肪来源干细胞作为种子细胞，并行DiI体外荧光标记，以Ⅰ型胶原支架为载体材料，将细胞成脂诱导后，以1×10^7／ml细胞密度与支架复合后接种于裸鼠左侧背部皮下，未诱导组不对细胞进行任何诱导，以相同方式接种于裸鼠右侧背部皮下，空白对照组将Ⅰ型胶原空白支架接种于裸鼠颈部正中皮下，每组各6只实验鼠；于第12周取材，通过大体和荧光显微镜观察、湿重测定、组织学检测和油红O染色定性判断体内成脂能力。结果原代培养的脂肪来源干细胞，经成脂诱导能演变为成熟脂肪细胞，油红O染色阳性。诱导组裸鼠皮下均发现新生组织块，新生物平均湿重为0．020g，常规病理切片及油红O染色均证实其为成熟脂肪组织，DiI荧光显色阳性证实其为外源性；未诱导组4只裸鼠皮下发现新生组织块，新生物平均湿重为0．014g，常规病理切片及油红O染色证实其含有部分成熟脂肪组织，DiI荧光显色阳性证实其为外源性，两组新生物湿重比较差异有统计学意义（P〈0．01）；空白对照组未见新生组织形成。结论用酶消化法从人脂肪抽吸术抽吸物脂质部分提取的细胞为脂肪组织来源干细胞，该细胞能作为种子细胞经成脂诱导后，与Ⅰ型胶原支架在体内成功构建脂肪组织。

脂肪组织来源干细胞提高游离脂肪移植存活率的研究

目的探讨脂肪组织来源干细胞移植在体内促进游离移植脂肪组织的再血管化，提高移植脂肪组织存活率的可行性。方法自人体吸脂术中脂质部分分离、培养ASCs，行成脂、骨和软骨分化。将ASCs以DiI标记后与人体吸脂术获得的脂肪组织混合移植于18只裸鼠背部，裸鼠背部随机注入3组移植物：ASCs组（A组）、胰岛素组（B组）及培养基对照组（c组）。术后6个月观察移植物情况，通过组织观察、HE染色和免疫组化进行分析。结果抽脂术脂质部分能获取大量的ASCs，能分化成脂肪、成骨和软骨细胞。术后6个月3组移植脂肪的湿重分别为A组（165．97±5．51）嘲，B组（93．42±5．12）mg，C组（67．64±5．09）mg。A组移植脂肪的存活率高于B、C组（P=0．000）。纤维化程度的测定，“网格点计数”3组移植物的点个数分别为A组（152．2±9.8）个／10HF，B组（743．9±20．4）个／10HF，C组（892．2±16．5）个／10HF。A组移植脂肪的纤维化及坏死程度低于B、C组（P=O．000）。免疫组化证实：ASCs散在分布于部分脂肪细胞及小叶间隔中，ASCs在体内能够部分转化为血管内皮细胞。结论脂肪组织来源干细胞移植在体内可促进游离移植脂肪组织的再血管化，提高移植脂肪组织的存活率并改善了移植物的质地。ASCs辅助移植可能是一种较为理想的细胞疗法。

人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究

目的探讨构建可注射型组织工程化脂肪组织的可行性，为临床修复软组织缺损寻求简便、微创的方法。方法采用酶消化法从人脂肪抽吸术的抽吸物中脂质部分获取人脂肪来源干细胞（ASC），以经成脂诱导和未经成脂诱导的ASC作为种子细胞，行DiI体外荧光标记后，分别以1×10^7个／ml细胞密度与纤维蛋白胶可注射支架复合。取6只裸鼠，将成脂诱导ASC-支架复合物注射于其背部左下方皮下（诱导组），未诱导ASC-支架复合物注射于背部右下方皮下（未诱导组），不加细胞的纤维蛋白胶注射于颈部正中皮下（空白支架组），每点注射0．2ml。第12周末处死裸鼠取出移植物，通过大体观察、湿重测定、常规组织病理学检测、油红O染色和DiI荧光标记检测判断体内成脂能力。结果诱导组和未诱导组均获得了外观类似脂肪组织的新生物，新生物湿重分别为（28±15）、（22±16）mg（t=23．238，P〈0．01）。诱导组新生物常规组织病理学检查及油红O染色均证实为成熟脂肪组织，DiI荧光标记呈阳性，证实为外源性ASC；未诱导组新生物中见少量成熟脂肪组织，大部分为纤维样结构；空白对照组未见新生组织形成。结论从人吸脂术抽吸物脂质部分提取的ASC能作为种子细胞，经成脂诱导后与纤维蛋白胶可注射支架复合，可在体内成功构建成熟脂肪组织。

瘢痕疙瘩家系外周血永生细胞库的建立

目的建立瘢痕疙瘩家系永生细胞库,为瘢痕疙瘩发病机制的研究提供永久的研究材料。方法采用EB病毒(Epstein-Barrvirus)转化技术,把瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系(LCL)。结果成功地为一个瘢痕疙瘩家系27个个体建立了永生细胞株,所有的细胞株冻存后复苏的成功率为100%。结论瘢痕疙瘩家系永生细胞库保存了原来个体完整的基因组,为以后的深入研究提供用之不竭的DNA资源。