医学检验本科生临床生化实验教学探讨

医学检验本科生的临床生物化学检验实验教学是培养学生实际操作能力和创新实践能力的重要途径。现有的实验课教材和教学方法要培养出真正切合临床需求的临床生化技术骨干仍存不足,结合几年来组织和参与临床生化实验教学的实践,探讨一些教学改革的体会,以期收到更好的教学效果。

多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌的基因组及耐药机制分析

目的对多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌进行全基因组分析,为研究其耐药机制提供依据。方法采用含美罗培南的MH培养基对粪便标本进行初筛,经BD Phoenix100全自动微生物鉴定仪进行菌种鉴定及药敏试验,提取耐药菌总DNA进行二代测序和细菌多位点序列分型(MLST),经质粒全基因组序列分析检测质粒的组分和功能,并与参考质粒进行比较,通过质粒接合转移实验分析耐药质粒传递情况。结果413份粪便标本中分离出1株多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌,该菌株对头孢菌素类、碳青霉烯类抗菌药物、复方磺胺甲噁唑的耐药率均为100%,对氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素等抗菌药物呈现不同程度耐药;MLST分型的耐药弗劳地枸橼酸杆菌为ST22型,该菌株共含有5412个基因,含耐药基因367个,包括碳青霉烯酶类耐药基因、AmpC酶基因、大环内酯类耐药基因、氨基糖苷类耐药基、喹诺酮类耐药基因等。质粒的全基因组分析结果显示,该质粒含碳青霉烯类耐药基因blaNDM-1、blaSHV12,该质粒与泄殖腔肠杆菌菌株ECN49质粒和肺炎克雷伯菌菌株质粒pA575-NDM有极高的同源性;质粒接合实验显示,blaNDM-1和blaSHV-12可以通过质粒转移。结论弗劳地枸橼酸杆菌耐药的主要原因之一是含有blaNDM-1、blaSHV-12等耐药基因,并且该耐药性能通过质粒进行水平转移。

临床实验室检验耗材全程信息化管理系统的建立与应用

依托杭州创业公司的LIS系统在临床实验室的应用，开发临床实验室检验耗材的信息化管理系统。该系统利用条形码作为载体，实现对临床实验室试剂与耗材的全程信息化追踪管理，具备随时查询或统计采购计划的制定、采购、进出库、开始使用、使用完毕、失效预警、高／低库存预警、使用效率、运营成本等功能。达到提高临床实验室试剂与耗材管理的效率并规范其使用、符合监管部门的管理要求、保障临床检验的质量等效果。

多重耐药鲍曼不动杆菌感染情况调查及耐药分析

目的了解该院多重耐药鲍曼不动杆菌感染及耐药情况,并评价医院新管理措施的控制效果。方法回顾性分析该院2009年11月至2011年10月期间384株鲍曼不动杆菌感染情况及耐药性特点,以及医院新管理措施实行前后的比较分析。结果该院多重耐药鲍曼不动杆菌检出率为15.1%(58/384),其中有82.7%(48/58)分离自呼吸道标本,科室分布以重症监护室(ICU)最多,占44.8%(26/58),对美洛培南和亚胺培南的敏感性最高(93.1%和94.8%),其次是丁胺卡那霉素(46.6%),其余均低于10%。按年份分组比较分析显示该院执行新医院管理措施后多重耐药鲍曼不动杆菌的检出率由25.8%(56/217)降到1.2%(2/167),差异具有统计学意义(P<0.01);鲍曼不动杆菌对常见7种抗菌药物(头孢他啶、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素和哌拉西林/他唑巴坦)敏感性显著提高(P<0.01)。结论医院新管理措施不但有效降低多重耐药鲍曼不动杆菌的感染率,还提高了鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性,值得进一步推广和加强。

脉冲场电泳分析布鲁菌标准菌株

目的探索一种布鲁菌分型的快速、准确、可靠的分子生物学方法。方法建立脉冲场凝胶电泳(PF-GE)的分子生物学分型方法,比较染色体限制性内切酶图谱,确定菌株的亲缘关系。结果在分析的19株布鲁菌标准菌株中,6种布鲁菌的PFGE图谱各不相同,但猪种菌和犬种菌的PFGE图谱只有1条带不同。羊种菌和猪种菌内各生物型均可在各自种内被区别,但牛种菌各生物型被区分为3类。从系统发生的观点来看,羊、牛、猪种菌是从共同祖先进化来的,犬种菌可认为是猪种菌的主要株或是刚从该种布鲁菌进化而来的株。沙林鼠种菌与牛种菌关系密切,而绵羊附睾种菌与猪种5型菌遗传距离也较近。结论PFGE方法可用于布鲁菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充。

AFLP法构建布鲁氏菌基因组DNA指纹图谱

目的采用扩增片段长度多态性(AFLP)分子遗传标志技术,分析布鲁氏菌基因组DNA多态性。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,经EcoRI/MseI酶切并与相应的人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增。结果经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建出多态性丰富、重复性好的布鲁氏菌DNA指纹图谱。结论AFLP法有望成为一种独立的切实可行的方案,在布鲁氏菌的多态性研究和流行病学调查中发挥作用。

江苏省无锡地区异常血红蛋白病的流行病学调查

目的:了解江苏省无锡地区异常血红蛋白病的流行病学调查。方法:10297人参加异常血红蛋白的电泳筛查,全自动血球分析仪检测各项红细胞参数,Gap-PCR与反向斑点杂交检测地贫及HbE,采用PCR-测序法检测异常血红蛋白点突变。结果:无锡地区的异常血红蛋白发生率为0.136%(14/10297)。本次筛查共发现8种异常血红蛋白,包括1例HbI、1例HbJ-Bangkok、1例HbUbe-2、1例HbJ-Beijing,1例HbHbG-Taipei,3例HbQueens,2例HbG-Coushatta和4例HbE。结论:江苏省无锡地区的异常血红蛋白病发生率低于全国平均水平,具有鲜明的南北交汇的基因特征。

尿胰蛋白酶原-2对急性胰腺炎早期诊断价值的系统评价

目的评价尿胰蛋白酶原-2早期诊断急性胰腺炎的诊断价值。方法检索MEDLINE、EMBASE、中国生物医学文献数据库(CBMdisc)、中国生物医学期刊文献数据库(CMCC)、中文期刊全文数据库(CNKI)等数据库,收集关于尿胰蛋白酶原-2诊断急性胰腺炎的相关文献,进行质量评价,利用MetaDisc软件进行异质性分析、Meta分析并绘制综合受试者工作特征曲线。结果纳入符合要求的文献55篇,采用QUADAS量表进行严格的文献质量评价,Meta分析显示55篇文献结果存在轻度异质性(P=0.0987,I2=20.3%);合并敏感度为92.2%(95%可信区间91.1%～93.2%),合并特异度为94.1%(95%可信区间93.4%～94.7%),综合受试者工作特征曲线下面积为0.9784(标准误0.0023),表明其平均漏诊率和平均误诊率均较低(分别为7.8%和5.9%),检测结果为阴性时病人患急性胰腺炎的概率为0.69%。结论免疫层析法检测尿胰蛋白酶原-2是一项灵敏而特异的急性胰腺炎早期筛查指标,阴性结果基本可以排除急性胰腺炎的可能。

慢病毒载体构建稳定的maspin表达敲减食管癌细胞株

目的前期研究表明maspin在食管癌组织中表达下调。文中利用慢病毒载体介导短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)感染食管癌细胞株,诱导maspin基因沉默,构建稳定的maspin表达敲减细胞株。方法合成maspin特异shRNA序列(shMas1和shMas2),构建shMas1和shMas2慢病毒表达载体;利用293FT细胞包装病毒后,感染食管癌细胞株HKESC-2;经嘌呤霉素筛选获得稳定感染细胞株。定量PCR和免疫印迹法检测干扰效果。结果成功构建shMaspin的慢病毒表达载体;与野生型HKESC-2细胞比较,获得的稳定maspin表达敲减细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2生长特性无明显变化,其maspin mRNA及蛋白质表达水平均明显降低,maspin mRNA敲减效率分别为37.8%及58.2%,maspin蛋白质表达的相对抑制率分别为49%和53%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了稳定的maspin表达敲减的食管癌细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2。

365例血培养阳性病原菌的分布及其耐药性分析

目的了解血培养中病原菌分布及其耐药性。方法采用Bactec 9120血培养仪及凤凰-100全自动细菌鉴定药敏系统对门诊和住院的血培养标本进行病原菌培养鉴定及药敏试验。结果2006年1月-2007年7月血培养共分离菌365株,其中革兰阳性菌116株(31.8%),革兰阴性菌197株(54%),真菌37株(10.1%)。革兰阳性菌以葡萄球菌属为主;革兰阴性菌以肠杆菌科细菌为主(55.8%,110/197),其次为非发酵菌(22.3%,44/197)。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)流行率分别为44.8%(30/67)和20.7%(6/29),ESBLs阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物耐药率均高于ESBLs阴性细菌;革兰阴性菌对碳青酶烯类抗菌药物仍保持较高的敏感性,培养阳性分布前三位的科室是血液科、小儿科和新生儿科。结论本院血培养阳性结果中条件致病菌所占比例及其耐药性较高,临床医生应及时了解血培养阳性病原菌的分布特征及耐药情况,合理使用抗生素,减少医院感染。

中国布鲁杆菌插入序列基因多态性的研究

目的分析国内83株布鲁杆菌基因组的插入序列(IS)IS711的遗传多态性。方法提取布鲁杆菌DNA,经内切酶EcoRI酶切、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印后,与地高辛标记的IS711探针杂交,以酶免疫试验检测信号,比较布鲁杆菌各株的IS711指纹图谱。结果不同布鲁杆菌菌株在IS711探针杂交图谱上有明显的多态性,根据杂交的条带数及片段大小的差异,83株布鲁杆菌分属15个IS型。以IS10型分布最为广泛,其次是IS3型,其他型别则较分散,有的IS型只存在于某个菌株。结论布鲁杆菌插入序列IS711在基因分布上存在多态性。

自动监测样品状态在临床生化检测中的应用

目的拓展全自动生化分析仪的功能,利用其自动判别样品的脂血、黄疸与溶血(LIH)状态,比较其与传统的肉眼判定结果的差异。方法编制特定的LIH检测程序,采用生理盐水作测定LIH级别的试剂,每日监测样品的LIH状态,460余份异常者同时测定其三酰甘油(TG)、总胆红素(TB il)及血红蛋白(Hb)含量。将95份仪器判别为存在LIH的样品与30份明显LIH的样品进行单盲人工判别,比较两者的一致性。结果仪器与人工判别样品有无黄疸和溶血及其严重程度差异无显著性;2种方法判断脂血状态有一定差异,对低TG水平[(3.02±1.81)mmol/L]的样品判别两者符合率较低;但TG浓度较高[(8.77±5.34)mmol/L]的样品,两者的符合率可达93.33%。明显溶血[Hb为(4.23±1.65)g/L]与黄疸[TB il为(198.61±132.95)μmol/L]的样品,两法判别的符合率均为100%。结论采用仪器自动判别样品的LIH状态结果比传统的手工法更为可靠,同时又极大地提高检验工作效率,具有很好的实用价值。

Olympus AU5400生化分析仪的测定误差及对策

目的测定O lympus AU5400模块式生化分析仪各分析系统间的误差,探讨用酶校准品校正仪器以减少其系统误差的可行性。方法由同一单元内、外圈,不同单元的同圈比色杯组成相应系统测定新鲜混合血清8项生化指标的批内精密度并比较其差异;再分别用3种酶校准品对系统进行校正,比较校正前后5项酶活性测定结果的差异和实际K值与理论K值的差异。结果AU5400的内、外圈的批内精密度均较好,变异系数CV为0.47%～1.59%。不同单元同圈比色杯测定8个项目的相关系数(r)为0.992～1.000,6个项目测定结果的差异均有统计学意义(P<0.01)。经酶校准品校正后,肌酸激酶(CK)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)与碱性磷酸酶(ALP)测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。乳酸脱氢酶(LDH)测定的比例误差由4.0%减小至0.7%;而丙氨酸氨基转移酶(ALT)比例误差和恒定误差均有所减小。同一单元内、外圈测定8个项目的结果高度相关(r=0.998～1.000);4个项目的结果差异有统计学意义(P<0.001)。经酶校准品校正后,ALT、GGT及LDH的结果差异均无统计学意义(P>0.05),而ALP的比例误差和恒定误差均有所减小,但差异仍有统计学意义(P<0.001)。不同酶校准品校正后的实际K值相差最大可达32.7%。结论AU5400的4个分析系统测定不同项目时,可产生较明显的比例误差和/或恒定误差;采用酶校准品进行校准后,大部分酶学项目的误差会显著减小,但少数项目的系统误差并不一定能完全消除。

OLYMPUS全自动生化分析仪性能鉴定

目的探讨全自动生化分析仪的性能鉴定方法和技术要素。方法对OLYMPUS AU2700生化仪进行温度准确度与波动、杂散光、吸光度线性范围、吸光度稳定性、吸光度重复性、吸光度准确度、加样误差、加试剂误差、样品携带污染率、项目准确性、项目的批内精密度和批间精密度等指标进行检查,并与行业标准和厂家说明书标准进行比对。结果孵育温度为(36.84±0.07)℃,波动度0.11℃,5只比色杯杂散光均大于4.10。吸光度线性范围不小于2.5时,各测定值相对偏倚在±5%以内。340、380、480、600 nm 4个波长的吸光度变化均远小于0.01。吸光度重复性CV值为0.450%。2 mL样品分配的精确度整体CV≤1.5%;5 mL样品分配精确度整体CV≤0.8%。内、外圈试剂分配精确度CV分别为0.40%和0.32%。5组测定的平均携带污染率为0.241 1%。ALP、Mg、P、AMY、Ca、AST、TP、ALB 8个项目定值质控的测定结果均在质控靶值±2sd范围之内。批内精密度与批间精密度介于0.953%～4.713%之间。ISE单元电极选择性[Na]=150 mmol/L,[K]=4 mmol/L。结论 OLYMPUSAU2700生化仪的性能符合最新的行业推荐标准,生化仪的性能鉴定应进一步完善与规范。

佐剂性关节炎大鼠细胞因子和淋巴细胞亚群变化与可铁宁的影响

目的:观察吸烟者体内尼古丁代替主要产物可铁宁在佐剂性关节炎动物模型抗炎和调节免疫方面的作用。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学南方医院检验科及实验动物中心完成。实验动物:SD大鼠50只。实验分组和给药:随机选取SD大鼠40只注射完全弗氏佐剂,致炎建立佐剂性关节炎模型,剩余的10只SD大鼠为正常组。将40只佐剂性关节炎大鼠随机分为炎症组10只,可铁宁低、中、高剂量组各10只,可铁宁各组于佐剂注射后1周开始灌胃给药,分别给0.5,1.5,4.5g/kg体质量剂量药物,连续7d。实验评估:致炎后28d开始进行运用ELISA及流式细胞术,检测用药后对白细胞介素1β、白细胞介素2,T细胞增殖等指标(CD4+,CD8+,CD4+/CD8+)的影响。结果:50只大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素2含量:与炎症组相比,可铁宁高、中、低剂量各组白细胞介素1β含量明显下降[(101.4±11.24),(53.40±8.23),(60.34±5.97),(72.31±8.06)ng/L,P<0.05],白细胞介素2含量明显升高[(121.3±21.2),(195.9±51.6),(174.3±40.3),(169.7±53.2)ng/L,P<0.05],且作用有一定的剂量依赖性。②各组大鼠淋巴细胞亚群CD4+,CD8+,CD4+/CD8+变化:造模第28天,与正常组相比,炎症组的CD4+增加,CD8+明显降低(P<0.05),CD4+与CD8+的比值显著增加(P<0.05);与炎症组相比较,可铁宁高剂量组的CD4+显著降低(P<0.05);可铁宁各组的CD8+明显增加(P<0.05),CD4+与CD8+比值显著下降,呈剂量依赖性。结论:可铁宁可调节大鼠血清中异常的白细胞介素1及白细胞介素2含量,可铁宁在试验动物水平有抗炎和免疫调节的作用。

时间分辨荧光免疫法定量检测AFP试剂盒临床应用研究

对自制AFP时间分辨荧光免疫法(TRFIA)试剂盒进行研究,为临床应用评价提供科学依据。收集血清标本450份,分别以化学发光免疫分析(CLIA)和RIA为对照,用AutoDELFIATMhAFP试剂盒为复核试验,测定血样,获取实验数据并计算“真实性”和“可靠性”。结果表明,CLIA及RIA为对照试验,其阳性符合率分别为99.0%和97.4%,阴性符合率分别为97.2%和94.1%,检验均无显著性差异(P>0.05)。本试剂盒的定量测定值与CLIA比较接近,相关系数为0.994,与RIA为0.917,两者相关性好(P<0.01)。本试剂盒检测性能能满足临床应用的需要。

稀释法在严重脂血标本凝血检测中的应用

目的建立严重脂血标本凝血检测的稀释法解决方案。方法随机收集30例正常外观血浆标本,分别检测原血浆和3倍稀释后PT和aPTT两项指标,将每项指标的两组数据进行统计学线性回归分析,得到各指标的回归方程。另外收集20例严重脂血标本,分别检测3 000 r/min离心10 min后3倍稀释血浆和10 000 r/min高速离心10 min后原血浆的PT和aPTT两项指标,对各回归方程进行验证。结果原血浆与3倍稀释后血浆的PT和aPTT两项指标检测值具有线性相关特征。20例严重脂血标本3倍稀释后的PT和aPTT两项指标检测值经过相应回归方程计算,所得数据与高速离心后检测数据无显著统计学差异。结论该解决方案可以适用于临床实验室严重脂血标本的凝血检测。

尿胰蛋白酶原-2与血清淀粉酶早期诊断急性胰腺炎诊断价值的循证评估

目的采用循证医学的方法评估尿胰蛋白酶原-2(TPS-2)和血清淀粉酶(SAmy)早期诊断急性胰腺炎(AP)的诊断价值与诊断效能,为临床医生和检验人员选择AP生化标志物提供最佳临床决策证据。方法检索MEDLINE、EMBASE、中国生物医学文献数据库(CBMDISC)、中国生物医学期刊文献数据库(CMCC)、中文期刊全文数据库(CNKI)等数据库,按照纳入标准收集TPS-2与SAmy诊断AP的研究文献,采用QUADAS量表进行严格的文献质量评价,利用MetaDisc软件进行异质性分析及定量合成,绘制SROC曲线,计算相应的验后概率。结果 44篇TPS-2与SAmy诊断AP的研究结果异质性分析,前者有中等程度的异质性(P=0.0417,I2=28.7%),而后者无显著异质性(P=0.1133,I2=21%);合并敏感度Sen分别为93%(95%CI:91%～94%)与81%(95%CI:79%～83%);合并特异度Spe分别为94%(95%CI:93.0%～95.0%)与86%(95%CI:85.0%～87.0%);SROCAUC分别为0.9788(SE=0.0025)与0.8965(SE=0.0058),差异有统计学意义(P<0.05),前者的综合诊断效能优于后者。TPS-2与SAmy结果阳性诊断AP的验后概率分别为55.32%与30.78%,阴性验后概率分别为0.69%与1.96%。结论检测尿液TPS-2诊断AP比SAmy具有更高的诊断价值,可作为AP诊断的过筛试验,阴性结果有99.31%的概率可排除AP的可能性。

重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病A患者的有效性及抑制物产生的观察

目的探讨重组人凝血因子Ⅷ(Kogenate FS,拜科奇)在中国血友病A患者的有效性、安全性及抑制物产生率。方法采用拜科奇治疗30例血友病A患者的出血事件,观察其临床止血效果及用药后4周FⅧ抑制物的产生情况。其中11例患者在用药前后进行血、尿便常规、肝肾功、血清病毒学(HBV、HCV、HIV)、FⅧ抑制物、FⅧ活性检测,并于第1次用药后10min、60min检测FⅧ活性;同时随访2年检测FⅧ抑制物。结果11例患者在用药后10min、60min较用药前FⅧ活性明显提高,达到或接近预期升高值;所有30例患者用药后出血症状停止,显效率达100。每次出血事件约86.7的患者在≤3次输注即可较好的控制症状,提示具有较好的有效性。30例患者共输注重组FⅧ70次,总计51294u,在用药期间无任何不良反应出现。本研究发现1例患者在用药后4周产生FⅧ抑制物,提示短期抑制物产生率为3.3(1/30),11例2年随访未见抑制物产生增加趋势。结论重组人凝血因子Ⅷ(Kogenate FS,拜科奇)在中国血友病A患者使用中具有较好的有效性、安全性及较低的抑制物产生率。