NOD2/CARD15基因突变与中国人克罗恩病相关性的研究

背景:近年多项研究证明NOD2/CARD15基因序列的单核苷酸多态性(SNP)与西方白种人克罗恩病(CD)明显相关,其中3个SNP(R702W、G908R和3020insC)与CD的相关性尤为显著。目的:探讨NOD2/CARD15基因SNP与中国人CD发病的相关性及其与CD临床特点的关系。方法:选取临床资料完整的CD患者48例、溃疡性结肠炎(UC)患者和健康对照者各50例,提取人血白细胞基因组DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增NOD2基因全部12对外显子,纯化后直接测序,根据结果分析其突变与CD病变特点的关系。结果:CD组、UC组和健康对照组均未检出3个西方人常见的NOD2/CARD15基因多态性位点。CD组的P268S突变率显著高于UC组和健康对照组(P<0.05)。5例P268S突变的CD患者病变均位于回肠(P<0.01),4例发病年龄≤20岁(P<0.01),且均并发肠腔狭窄(P<0.01)。结论:中国人CD患者中存在NOD2/CARD15基因P268S突变,且与患者的发病年龄、病变部位和并发症相关,有必要对其功能作进一步探讨。

ADP-核糖基化因子1的功能及其与肿瘤相关性的研究进展

ADP核糖基化因子(ADPribosylationfactor,ARF)家族作为霍乱毒素催化GS蛋白ADP核糖基化反应的辅助因子,目前其病理生理作用仅对从功能角度定义的这一蛋白家族有价值,而进一步研究发现,ARF与高尔基复合体息息相关,在细胞内物质运输和信号转导过程中具有更加重要的生理功能。在这一蛋白家族中发现最早、研究最深入的是ADP核糖基化因子1。作者就此蛋白的调控分子和效应分子、功能及其与肿瘤的相互关系作一综述。

survivin启动子有效片段的克隆及其在胃癌细胞AGS中的转录活性研究

目的克隆survivin启动子的有效片段,并检测它在人胃癌细胞株AGS和人正常胃上皮细胞GES-1中的转录活性,为该启动子在胃癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法用PCR扩增survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3-sur-pro重组质粒,用脂质体法瞬时转染AGS及GES-1中,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3-CMV-pro重组质粒作为阳性对照。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增的survivin启动子片段长约440bp,测序结果与GenBank中survivin启动子序列一致。成功构建了pGL3-sur-pro重组质粒。荧光素酶活性检测显示,survivin启动子片段在细胞株AGS中有较高转录活性,而在GES-1中几无转录活性。结论本实验克隆的survivin启动子有效片段在胃癌细胞株AGS中有转录活性,在正常胃上皮细胞中无活性。其有可能作为调控元件用于胃癌的靶向性基因治疗。

X线照射对大肠癌细胞株Lovo细胞膜TNFR-p75表达的研究

目的研究X线照射在体外培养人大肠癌细胞株Lovo后,其膜TNFR-p75表达情况。方法免疫细胞化学检测TNFR-p75蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率,光镜及透射电镜观察细胞形态变化。结果X线照射后的TNFR-p75蛋白表达显著增强(P<0.01);光镜及电镜发现细胞体积缩小,变圆,核缩小,染色质凝集,染色质呈颗粒、块状均质无结构样物质,细胞间散在膜包裹的凋亡小体;流式细胞仪分析细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。结论X线可通过上调TNFR-p75蛋白的表达抑制其脱落,诱导细胞凋亡增强照射肿瘤的杀伤作用。

克罗恩病58例临床特点分析

目的通过分析住院患者的临床资料,以期提高克罗恩病(CD)的早期诊断水平。方法对该医院1996年1月～2005年5月58例出院诊断为CD患者的临床表现、确诊时间、诊断方法、不同时期血沉、CRP的变化、误诊情况以及治疗和预后等进行总结和回顾分析。结果腹痛(86.9%)、腹泻(69.6%)为本组患者最常见的胃肠道症状,消化道出血(32.7%)、肛周病变(18.9%)的发生率亦较高。病变在回盲部者35例(60.3%)。56例活动期CD和18例复发期CD的血沉和CRP比其缓解期明显增高。结肠镜、消化道X线、胶囊内镜及双气囊推进式小肠镜检查的阳性率分别为77.1%,63.2%,75%及100%。内镜活检病理发现非干酪性肉芽肿10例(27.8%)。初诊误诊24例(41.4%)。糖皮质激素联合5-氨基水杨酸治疗活动期CD缓解47例(81%)。结论CD临床表现复杂多样,误诊率高,血沉及CRP在CD随访中有一定价值。CD好发于回盲部。结肠镜检查是末段回肠和结直肠病变最主要的诊断方法,双气囊推进式小肠镜对早期诊断小肠CD有重要价值。确诊CD不依赖于病理发现非干酪性肉芽肿,需结合病史、临床表现、X线钡餐、内镜及病理综合判断。

大肠侧向发育型肿瘤细胞株ADP-核糖基化因子1的表达及其意义

背景与目的:侧向发育型肿瘤(Laterally Spreading Tumor,LST)有高恶变倾向。本研究目的是为了发现与大肠侧向发育型肿瘤(ColorectalLST,CLST)生长、发育方式密切相关的基因和功能蛋白,揭示LST侧向生长方式和高恶变潜质的分子肿瘤学机制。方法:应用全人类表达谱基因芯片筛选CLST、LoVo、SW480三株结肠癌细胞株差异表达的基因。从中选取差异比较显著的基因,应用半定量RT鄄PCR和蛋白免疫印迹从mRNA和蛋白表达两水平验证差异表达。结果:基因芯片筛查出LST相对于LoVo和SW480表达上调基因58条,下调基因39条。根据文献选取ADP鄄核糖基化因子1(ADP-ribosylationfactor1,ARF1)通过RT-PCR验证表达确实存在差异,而蛋白免疫印迹则显示CLST和LoVo的差异显著,和SW480的差别不显著。结论:CLST在基因表达上存在特殊性,其中ARF1在CLST表达水平较高,提示其可能介导与CLST特性有关的生物学功能,二者的相互关系值得进一步研究。

P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体的构建及其体外表达

背景:NOD2/CARD15基因序列单核苷酸多态性(SNP)与欧美人群的克罗恩病(CD)明显相关,其中R702W、G908R和3020insC3个SNP位点与CD的相关性尤为显著。而日本、韩国以及我国香港和浙江地区的研究均未发现上述3个SNP的改变,但最近研究发现了可能与中国人CD相关的P268S突变。目的:构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体和体外转染体系,为研究突变型NOD2/CARD15的功能提供实验基础。方法:应用定点诱变技术构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人胚肾细胞HEK293T,以蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HEK293T细胞NOD2/CARD15的表达。结果:经克隆、酶切、测序证实获得P268S突变型NOD2/CARD15基因,突变载体转入HEK293T细胞后,NOD2/CARD15有效表达。结论:成功构建了P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,阳离子脂质体是人胚肾细胞有效的体外转染体系。

幽门螺杆菌感染的药物治疗新进展

0引言 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H pylori)的发现已有20 a的历史.近20 a来,在胃肠病工作者全面而深入的研究下,H pylori已被确认是慢性胃炎和大部分消化性溃疡的重要病因,与胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤密切相关,与胃癌的关系也越来越受到人们的重视,世界卫生组织已经将H pylori列为第一类致癌因子,并明确为胃癌的危险因素[1-2].

2,4,6-三硝基苯磺酸诱导小鼠炎症性肠病模型的建立

目的:建立2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎动物模型,并分析其剂量效应。方法:实验于2006-05/09在南方医院消化内科研究所完成,选用SPF级雌性Balb/c小鼠50只,按随机数字表法分为5组,每组10只,对照组予以300g/L乙醇溶液灌肠1次;其他4组分别给予含25mg/kg,50mg/kg,100mg/kg,150mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸的300g/L乙醇溶液灌肠1次。各组于造模后3,7,21,28d各处死1只小鼠,观察结肠的大体形态。造模后21d观察各组小鼠结肠的病理组织切片,并检测中性粒细胞的髓过氧化物酶活性。结果:造模过程中50,100,150mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组各死亡2,3,3只小鼠。①各组小鼠造模后的一般情况:对照组及25mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组小鼠发生一过性的结肠机械损伤表现,出现便血等现象,但3～7d后开始缓解;而50～150mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组小鼠出现便血,腹泻。②各组小鼠结肠的大体形态及病理组织学观察结果:对照组和25mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组小鼠肠道在第7天时表现为无粘连,局部充血,肠壁不增厚,未见溃疡,于第3周时局部充血已好转;结肠病理切片大致正常。50～150mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组小鼠肠道肉眼可见粘连,肠腔增大,充血水肿,溃疡形成,出现肠道增厚,病理切片见黏膜下层水肿,固有层炎症细胞浸润等现象,以上现象于造模4周后开始缓解。其中当2,4,6-三硝基苯磺酸剂量为100mg/kg时作用达到高峰。③各组小鼠的中性粒细胞髓过氧化物酶活性比较:50,100,150mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸组均显著高于对照组[(14.17±3.33,18.50±2.33,18.17±1.50,4.83±2.00)nkat/L,(P<0.01)]。结论:应用含100mg/kg2,4,6-三硝基苯磺酸的300g/L乙醇溶液灌肠是诱导小鼠结肠炎较为理想的方法。

应用基因芯片技术筛查大肠癌相关基因

目的:筛选与大肠癌相关的差异表达基因方法:用包含8 000个cDNA的基因芯片法检测4例大肠高分化腺癌组织及其癌旁正常肠黏膜组织标本RNA表达谱, 通过对比分析寻找与大肠癌相关的基因. 结果:大肠癌差异表达基因中有1 807个基因发生了显著性变化,其中上调表达的基因有936个,最有显著上调的有36 个;下调表达的基因有871个,最有显著下调的有30个. 结论:大肠癌的发生是—个多基因表达失调的过程,大肠癌与癌旁正常肠黏膜组织间存在差异表达的基因.

Galectin-3 shRNA载体的构建表达及其对大肠癌细胞lovo增殖率的影响

目的:构建galectin-3shRNA真核表达载体,观察该基因的抑制对大肠癌细胞系lovo细胞增殖率的影响.方法:以未转染lovo细胞作为阳性对照组,转染空质粒的lovo细胞作为阴性对照组,将针对人galectin-3基因的不同部位设计的长度约140bp的shRNA,插入到真核表达载体PRNAT-U6.1并转染人大肠癌细胞lovo,双酶切鉴定重组载体,免疫荧光检测转染效果,RT-PCR和Western-Blot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制,MTT测定干扰后对lovo细胞增殖率的影响.结果:双酶切出一条约120bp的DNA片断,与插入片断长度相符.PRNAT-U6.1/Galectin-3shRNA表达载体顺势转染lovo细胞72h后检测转染效率及Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达情况,免疫荧光检测转染效率为62%.转染PRNAT-U6.1/Galectin-3shRNA的lovo细胞Galectin-3的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,各组间比较F=2.214,148.566,P=0.000,0.000,阴性组和阳性对照组相比,P=0.448,0.263.干扰后细胞继续生长,与干扰前相比,生长明显减慢,F=20.830,P=0.000,组间比较F=149.710,P=0.000,shRNA干扰组与阴性组和阳性组比较,P=0.000,0.000.结论:成功构建Galectin-3shRNA表达载体,干扰后Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达明显降低,Galectin-3表达的抑制可能会导致大肠癌细胞lovo增殖率的降低.

结直肠锯齿状癌变途径的分子基础

锯齿状癌变途径是近年提出的概念,用来解释一部分缺乏染色体不稳定性结直肠癌的发生,包括部分增生性息肉、无蒂锯齿状息肉、锯齿状腺瘤和混合性息肉。早期发生BRAF突变、DNA高甲基化以及微卫星不稳定是大部分这类息肉的分子特征,经典的Wnt信号通路在这条途径中可能不起主要作用。

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌(H.hepaticus)甲基基团接受趋化信号转导蛋白(MCP)基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+),构建MCP的原核表达质粒pET22b+/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b+/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。

结直肠锯齿状癌变途径及β-catenin在其中的作用和调控机制

结直肠锯齿状癌变途径是近年来提出的大肠癌发生的一条新的癌变途径,包括增生性息肉、无蒂锯齿状腺瘤、传统锯齿状腺瘤、混合性腺瘤。与传统的腺瘤-癌途径不同,以β-catenin为核心的经典WNT信号通路在锯齿状癌变途径中可能不起主要作用。β-catenin在锯齿状癌变途径中主要起黏附作用。β-catenin粘附和转录功能的调控机制包括翻译后修饰(磷酸化)和构象变化(C端折叠)。

干细胞技术与肝硬化:共性与个性的新实践

干细胞横向分化(transdifferentiation)的能力,在肝脏再生过程中发挥作用,随着对干细胞的深入研究,干细胞技术为终末期肝病的治疗提供了新思路。本文对干细胞加以分类并综述了各种干细胞研究进展,对干细胞在肝脏疾病细胞治疗上的应用及前景作了总结和展望。

双气囊电子小肠镜检查的护理配合

笔者报道55例进行双气囊电子小肠镜检查慢性消化道出血病人的护理配合。总结术前准备、术中配合及术后护理,认为:清楚地认识双气囊电子小肠镜整体结构、工作原理,术前做好病人及器械的准备,术中准确熟悉地配合术者进镜、做各种治疗,术后做好内镜的消毒保养等,是内镜室护士的配合重点。

pSUPER-Rac1-siRNA质粒的构建表达及对肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制

目的使用pSUPER作为产生siRNA的载体,构建针对Rac1的siRNA表达载体,并观察其对肝癌HepG2细胞中Rac1蛋白表达的抑制作用,同时研究Rac1蛋白表达抑制后肝癌细胞HepG2的体外增殖情况。方法合成用于产生针对Rac1的发卡状RNA的寡核苷酸,含64个碱基,退火后插入线性化pSUPER载体的H1启动子下游。重组载体经限制性酶切和测序,构建载体pSUPER-Rac1-siRNA,并将其转染肝癌细胞系HepG2。空载体pSUPER-Control-siRNA作为阴性对照。Western blotting检测转染质粒后细胞内Rac1基因的变化,MTT法检测Rac1蛋白表达后体外细胞增殖情况。结果成功构建了可以表达针对Rac1的siRNA表达载体pSUPER-Rac1-siRNA。转染该载体能有效地下调HepG2细胞中Rac1蛋白的表达,受抑制率为82%。MTT检测结果显示,抑制Rac1蛋白表达后,细胞增殖速度明显减慢。结论成功构建了针对Rac1的发卡状RNA表达载体pSUPER-Rac1-siRNA,其可以高效而特异地下调HepG2细胞内靶基因Rac1的表达。Rac1蛋白沉默对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用,说明其在细胞的体外生长过程中具有重要作用。

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。

肾上腺副神经节瘤引起顽固性腹泻1例

1例顽固性腹泻患者,经影像学初步诊断,病理组织学确诊为肾上腺副神经节瘤,为一罕见病例．