人碱性成纤维生长因子重组质粒的构建

目的通过基因体外拼装（PBGA）获得带有BamHI和PstI内切酶位点的重组人碱性成纤维生长因子（rhbFGF）cDNA，并利用TA克隆技术构建含rhbFGF基因片段的重组质粒。方法（1）根据己知的hbFGF氨基酸序列并结合乳酸链球菌蛋白表达密码子来设计适于乳链菌内表达的hbFGF基因序列，分别在5’和3’端设计BamHI和PstI酶切位点，通过DNASTAR6．0将上述目的基因序列设计成22个可以相互重叠的寡核苷酸片段，bFGFl-bFGF22。（2）采用基因拼装技术，通过PCR反应，拼接I～22段寡核苷酸片段，合成带有设定内切酶位点的rhbFGFcDNA。（3）构建rhbFGFTA克隆载体。纯化上步拼接rhbFGF基因片段，产物与PMD18-TVECTOR进行连接反应。连接产物转化于E．coliTOP10感受态细胞，涂板、筛选、培养后提质粒，酶切鉴定并测序。结果（1）体外拼装带有BamHI和PstI内切酶酶切位点的rhbFGFcDNA经2％琼脂糖电泳验证；（2）构建了载体hrbFGF—PMD18，经酶切鉴定和测序证实碱基序列完全正确。结论利用PBGA和TA克隆技术可成功构建rhbFGF．PMD18重组质粒。