活性氧调控Bcl-2、Bax表达参与热打击后人脐静脉内皮细胞凋亡的研究

目的 观察热打击后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内活性氧（ROS）爆发性增高调控Bcl-2、Bax表达对凋亡的影响,探讨重症中暑所致血管内皮损害的发病机制.方法 建立HUVEC热打击模型.将细胞分别置于39、41、43 ℃细胞培养箱中进行热打击2h,然后置于37 ℃、5％ CO2细胞培养箱后继续孵育24 h;在43 ℃热打击前以10μmol/L ROS特异性清除剂MnTMPyP预处理lh进行干预.对照细胞仅置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中孵育.应用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）法及二氢乙啶（DHE）法检测细胞内ROS表达;使用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡;采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bcl-2、Bax的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测Bcl-2、Bax及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的蛋白表达;同时检测MnTMPyP对热打击后细胞凋亡的影响.结果 与对照组比较,39℃热打击对细胞凋亡无影响,随着热打击温度增加至41℃、43℃时,细胞存活率呈进行性下降,ROS爆发性增加,Bax的mRNA和蛋白表达以及caspase-3蛋白表达显著增加,Bcl-2的mRNA和蛋白表达显著降低,且呈温度依赖性,其变化以43℃热打击最为明显[细胞存活率：（46.00±4.00）％比（96.33±1.53）％,t=20.164,P=0.001;ROS（荧光相对值）：400.67±12.10比99.33±4.04,t=32.909,P=0.001;Bax mRNA（A值）：3.03±0.15比1.00±0.00,t=23.056,P=0.001;Bax蛋白（灰度值）：3.97±0.21比1.00±0.00,t=24.684,P=0.001;caspase-3蛋白（灰度值）：4.80±0.20比1.00±0.00,t=32.909,P=0.001;Bcl-2 mRNA（A值）：0.42±0.30比1.00±0.00,t=33.072,P=0.001;Bcl-2蛋白（灰度值）：0.39±0.25比1.00±0.00,t=42.212,P=0.001].MnTMPyP预处理可明显逆转43℃热打击对HUVEC的损害,可明显抑制Bax、caspase-3表达,上调Bcl-2表达[BaxmRNA（A值）：2.00±0.20比3.33±0.25,t=7.184,P=0.002;Bax蛋白（灰度值）：2.03±0.25比3.23±0.25,t=5.840,P=0.004;caspase-3蛋白（灰度值）：2.07±0.21比5.00±0.20,t=17.600,P=0.001;Bcl-2 mRNA（A值）：0.71±0.40比0.42±0.26,t=8.126,P=0.002; Bcl-2蛋白（灰度值）：0.57±0.31比0.40±0.06,t=5.091,P=0.007].结论 热打击后HUVEC内ROS爆发性增高在凋亡中发挥了重要作用,其机制与调控凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达有关;血管内皮细胞凋亡可能是重症中暑的发病机制之一.

血小板线粒体功能在脓毒症病情监测的意义

目的通过检测外周血小板线粒体的通透性转变孔、跨膜电位和三磷酸腺苷(ATP)水平,探讨血小板线粒体功能与脓毒症严重程度的关系。方法取雄性SD大鼠40只,按照随机数字表法分为脓毒症模型组(A、B、C组)和假手术组(D组)。模型组予以盲肠结扎穿孔术(CLP)处理,按照盲肠结扎长度占盲肠总长度的10%、30%、50%依次分为A、B、C组。24 h后收集外周血,检测外周血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6等炎症因子水平,以及血小板线粒体通透性转变孔、跨膜电位和ATP水平的变化,采用One-way ANOVA检验法判断上述指标与脓毒症严重程度的关系。收集临床脓毒症病例29例并根据病情进行APACHEⅡ评分,收集外周血标本检测同期血小板线粒体功能,采用Spearman法分析其与APACHEⅡ评分的相关性。结果在动物模型中,随着CLP程度的加重,大鼠外周血小板线粒体钙黄绿素荧光减弱,跨膜电位显著下降,ATP合成减少,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。在临床标本中,APACHEⅡ评分与血小板线粒体ATP水平呈负相关(r=-0.895,P<0.05)。结论外周血小板线粒体功能可作为脓毒症病情监测的有效指标。