小鼠,模式生物中的“常青树”

回顾了小鼠走进实验室的发展历程,并结合实际介绍了自发突变小鼠、基因修饰小鼠在生命科学研究和生物医药发展中的科学意义和应用价值,展望了基因修饰小鼠模型的研发新技术。

BMP-2体外诱导OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化的实验研究

目的探讨骨形成蛋白-2（BMP-2）对OPG-/-小鼠骨髓间充质干细胞（BMsCs）体外定向诱导成骨的能力，评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取OPG-／-小鼠股骨，分离骨髓基质细胞进行体外培养，传至P，代时改用条件培养基，在15％FBS培养条件下培养基中分别加入：农度为0．3岭、0．2ug、0．1ug、0．05ug、0ug的BMP-2，并依次记为A、B、c、D和E组。细胞培养至1、3、5、7d，PNPP法测定碱性磷酸酶（ALP）、钙试剂盒测定细胞钙含量、酶联免疫法测定细胞上清中抗酒石酸酸性膦酸酶5b（TRACP5b）的表达，检测不同浓度BMP．2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果ALP活性和钙含量检测显示，A组和B组较其他组增加明显（P〈0．05），但A、B组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。TRACP5b检测显示，A、B、c组第3、5和7日TRACP5b表达均低于D、E组（P〈0．05），但A和B组差异不显著（P〉0．05）。结论BMP-2活性多肽能有效地促进OPG-／-小鼠BMSCs向成骨方向分化，其诱导作用存在剂量依赖关系，最佳诱导剂量为0．2ug／ml。

潮霉素和新霉素抗性基因转基因小鼠的建立及其表达研究

建立潮霉素 (hygromycin ,hyg)和新霉素 (neomycin ,neo)抗性基因转基因小鼠系 ,以获得两种抗性基因同时表达的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs) ,为条件性基因剔除或小鼠胚胎干细胞克隆的筛选创造条件。将pTK hygR pA ,PGK neoR pA两个转录单元分别克隆至pBluescript载体中获得hygR neoR 双抗性基因表达质粒 ,以KpnⅠ和XbaⅠ双酶切 ,回收 4 2 4 5bp串联基因片段 ,经显微注射获得HygR neoR 转基因小鼠。PCR及Southernblot鉴定转基因小鼠基因型 ;RT PCR检测hygR、neoR 基因在转基因阳性小鼠组织及MEFs中的表达。经显微注射共获得 7只转基因阳性小鼠 (Founders,G0代 ) ,经交配繁育 ,建立了 6个转基因小鼠系。RT PCR检测其中 5个转基因阳性小鼠系F1代杂合子成年雌性小鼠肝脏、卵巢组织中hygR 、neoR 基因的表达 ,发现hn30 ,hn33,hn6 6和hn6 7系阳性小鼠的 1种或 2种组织中有hygR 、neoR 的表达 ;RT PCR检测发现hyg和neo抗性基因在从hn30和hn6 6系分离培养的MEFs中表达。通过显微注射 ,建立了表达hyg neo抗性基因的转基因小鼠系 ,转基因表达检测发现两个转基因小鼠系的胚胎成纤维细胞中表达双抗性基因。

转基因小鼠技术研究进展

近年来,以转基因小鼠为代表的转基因动物技术迅猛发展,其在探讨基因功能、动物遗传改良、生物反应器、动物疾病模型、器官移植等领域均展现出了广阔的应用前景。论文综述了体细胞核移植技术、锌指核酸酶-基因打靶技术、病毒载体法、转座子介导的基因转移法、RNA干扰介导的基因敲除法等新发展起来的一些代表性重要方法,对其优缺点进行了较为系统的概述,指出了该技术目前存在的问题,并对其发展前景进行了展望。新的转基因小鼠技术将为转基因研究提供更好的平台,有望加快促进人类医药卫生、畜牧生产等领域的进一步发展。

BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响.

牙齿修复相关转基因研究:显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G_0代的实验观察

目的:为便于进行规模化的转基因研究,构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系。方法:实验于2002-06/10在上海南方模式生物研究中心完成。以cβ-actin启动子取代pTet-on-NSE质粒中的NSE启动子,构建转基因载体pTet-on-CX;将XhoI酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后,经PCR及SouthernBlotting检测阳性小鼠。结果:注射的受精卵共存活603枚,移卵后产仔64只,阳性6只。阳性鼠分别传代开始建系。结论:通过显微注射的方法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠的G代,0为规模化的转基因研究包括与牙齿修复有关的基因,如牙本质涎磷蛋(白基因)奠定了基础。

Wnt/LRP5信号途径影响骨量及成骨细胞功能研究进展

LRP5功能丧失性突变可以导致骨质疏松，功能获得性突变能够导致高骨量，LRP5在骨量的积累过程中具有十分重要的作用。LRP5可作为 Wnt 蛋白的跨膜受体，通过 Wnt/LRP5信号途径调节成骨细胞的增殖分化等功能来影响人体骨量的积累。

核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究

采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽(GSSG)加入时间对复性效果的影响。结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系(先加GSSG的含2mol·L-1尿素的稀释复性缓冲溶液)时,复性纯化后Onconase含量和回收率明显高于醋酸沉淀复性法。

小鼠Binlb基因的抗菌活性研究及其转基因小鼠的建立

我们在真核细胞中表达了小鼠Binlb基因,证实了它的抗菌活性,并进一步证明了该蛋白C端融合HA抗原决定簇后基本不影响蛋白的生物活性,为开展这一蛋白的转基因小鼠工作提供了较理想的转基因材料。同时我们利用四环素调控的基因表达系统(Tet-on系统)分别建立了附睾专一性表达rtTA的转基因小鼠和由TRE控制的mBinlb-HA的转基因阳性小鼠。这项研究对于我们理解mBinlb在体内的生理和病理作用提供了进一步研究的基础。

转Bin1b基因小鼠前列腺癌细胞的差异蛋白质组学初步研究

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤。目前治疗方法主要有手术治疗、化学治疗和放射治疗。实验研究的抗菌肽是一类在生物体内天然存在具有杀灭细菌和真菌的小肽。Binlb是在大鼠附睾中专一表达的抗菌肽.Binlb高表达的细胞和Binlb稳定转染细胞具有一些相同的表型。其中Binlb高表达小鼠前列腺癌细胞证实具有抗大肠杆菌和葡萄球菌活性。为了深入研究Binlb调节基因表达的机制，用LTQ-Orbitrap研究Binlb高表达所引起细胞内蛋白水平的变化。

显微注射法制备遗传工程小鼠模型的研究

遗传工程小鼠模型是基因功能、人类疾病发病机制及新药研究开发的最重要的模式生物之一。在建立遗传工程小鼠模型的众多方法中 ,显微注射法是目前国际上公认的制备转基因及基因剔除动物模型的首选。在进行了大量显微注射工作后 ,简要介绍建立遗传工程小鼠模型的基本技术与方法 ,并对在显微操作过程中较为关键的因素进行一些分析和讨论。

哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

体细胞核移植技术具有十分诱人的应用前景 ,在农业、物种保护、医疗等领域已显示出优越性。然而核重构等核移植基础理论方面的研究还很薄弱 ,致使核移植技术还不很完善 ,克隆动物还存在着甲基化酶异常调节、不正确的印迹基因表达、X染色体异常激活等错误的表观遗传现象 ,移植成功率较低 ,在一定程度上限制了它的发展。根据近几年的研究进展 ,对核移植技术的应用。

源于129S1品系的小鼠胚胎干细胞系的建立及其生物学特性分析

从129S1小鼠早期胚胎的内细胞团分离、培养类胚胎样细胞,经反复传代,成功地建立了129S1小鼠胚胎干细胞系,命名为NM-2细胞系。形态学鉴定具有胚胎干细胞的典型形态特征,正常核型率为80％;呈碱性磷酸酶阳性、表达胚胎干细胞特异性转录因子OCT-4;体内分化后可形成源于三胚层的组织结构;经囊胚腔显微注射后所获得的子代个体中79％具有毛色嵌合表型;雄性嵌合个体中31％发生生殖腺嵌合;同时,通过育种观察到所有生殖腺嵌合体的子代小鼠表型正常。以上结果证实NM-2细胞系为一株具高生殖腺嵌合能力的小鼠胚胎干细胞系。

人工合成囊素三肽的急性毒理研究——对农村生产影响

囊素三肽是从鸡法氏囊抽提液中提取的一种称为Bursin的三肽物质,氨基酸顺序为Lys-His-GlyNH2。本实验利用尾静脉注射给药的方式研究了单剂量条件下人工合成的囊素三肽对实验小鼠的急性毒性作用。研究表明,以10mg/kg高剂量通过尾静脉注射给药方式一次性注射到ICR小鼠体内未见毒性反应发生;小鼠体重、行为活动、状态、大便、小便、毛色、分泌物及死亡等情况也未见异常;血生化指标和脏器病理检测也未发现病理异常和特异性病变,证明人工合成的囊素三肽对实验小鼠无明显急性毒性作用,应用较安全。

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化(英文)

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变,骨保护素(OPG)可能是联系两者的分子之一.构建替换型载体pXpPNT-OPG,利用同源重组,将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉.通过胚胎干细胞(ES)基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆,ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠,交配传代获得杂合子和纯合子小鼠.RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示,纯合子小鼠没有Opg基因的表达.纯合子小鼠骨量丢失明显,骨生物力学指标明显下降,发生严重的骨质疏松,此外,还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化.小鼠破骨功能亢进,与此同时,成熟成骨细胞数量增加,矿化功能强于野生型.Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失,而血清中水平没有变化,这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因.对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究,将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制,为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.

利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型

血友病乙是由凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 m RNA和带有靶位点的sg RNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(FactorⅨcoagulant activity,FⅨ:C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明,利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的:建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型,为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具.方法:通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选,再通过Southern杂交进一步确证;利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化.结果:将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射,然后植入30只假孕母鼠的输卵管中,其中26只母鼠怀孕,移植成功率为86.67%;共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因,转基因阳性小鼠比例为5.03%(9/179),Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠;随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症,鼻咽黏膜上皮灶性增生.结论:成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠,且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生,可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.

Adiponectin基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.

Cbfαl对釉原蛋白转录调控作用的初步分析

目的:研究Cbfαl对釉原蛋白启动子转录活性的影响。方法:利用生物信息学的方法分析釉原蛋白启动子区域的序列,确定可能存在的结合位点,将利用PCR及酶切的方法从小鼠C57BL/6J基因组上扩增的、不同长度的釉原蛋白启动子构建的虫荧光素酶报告载体与Cbfαl共转Hela细胞,分析Cbfαl对不同长度的启动子转录活性的影响,将包含整个启动子区域的报告载体与Cbfαl共转Hela、CHO、UMR-106细胞,分析在不同细胞中Cbfαl对全长启动子转录活性的影响。结果:在Hela细胞中,Cbfαl对各段启动子都有激活作用,且该作用不随着启动子长度的变化而变化,在CHO、UMR-106细胞中,Cbfαl对启动子转录活性的影响很弱。结论:在Hela细胞中,Cbfαl对釉原蛋白启动子的转录活性有明显的增强作用,而且在对逐步缩短的启动子表现出一致的增强效能。结合生物信息学对Cbfαl结合位点的分析,可以初步判断在启动子下游,第一个内含子中存在Cbfαl的作用位点。另外,这种增强作用表现出明显的上皮细胞特异性,表明Cbfαl对釉原蛋白启动子的增强作用是有组织特异性的。