新生大鼠心肌细胞分离与原代培养

目的应用酶消化法消化心肌组织、培养心肌细胞.方法 0.1%的胰蛋白酶重复消化乳鼠心肌组织多次,收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后过滤,纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果培养的心肌细胞4～6 h后开始贴壁生长,12～24 h明显增殖,3～4 d后细胞汇合成片.在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形、梭形、多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动.结论应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的心肌细胞.

蛇床子素对阳虚症小鼠影响的实验研究

目的研究蛇床子素对阳虚症小鼠的影响。方法①建立氢化可的松致阳虚小鼠模型,测定小鼠性腺器官、肾上腺及免疫器官的重量,测定小鼠体重、体温、自主活动和游泳时间。②研究蛇床子素对幼年雄性小鼠及去势雄性小鼠性腺器官重量的影响;③测定LD50。结果①蛇床子素(150mg/kg)可增加肾阳虚雄性小鼠睾丸、附睾和精液囊脏器系数;增加小鼠的体重,延长游泳时间。②蛇床子素(150mg/kg)可增加雄性幼鼠的体重、精液囊脏器系数和去势小鼠精液囊、包皮腺脏器系数。③蛇床子素经口的LD50为3.60±0.40g。结论蛇床子素对氢化可的松所致的阳虚小鼠和去势小鼠症状有一定改善作用。

严重烧伤早期大鼠脾脏Toll样受体4的表达及意义

目的:探讨Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在严重烧伤早期炎症过程中的作用。方法:建立大鼠30％体表面积Ⅲ度烧伤模型,在烧伤前及烧伤后2、5、8、12、24、48、72 h等不同时间点留取脾脏组织和外周血,采用RT-PCR方法检测脾脏TLR4、TNF-αmRNA表达,Western印迹法检测脾脏TLR4蛋白表达,鲎试剂法测定血浆内毒素(ET)含量。结果:与正常对照组比较．严重烧伤可明显上调TLR4、TNF-α的表达及ET水平(P<0．01或P<0．05)。TLR4 mRNA、蛋白及ET均在烧伤后8 h达高峰,TNF-α表达高峰在烧伤后12 h(P<0．01)。伤后TLR4 mRNA的表达与ET和TNF-αmRNA之间均呈正相关(r=0．811,0．462)。结论:严重烧伤可导致血中ET升高,并上调脾脏组织TLR4的基因以及早期炎症因子TNF-α的基因表达,TLR4的上调可能参与了严重烧伤后失控性炎症反应的病理生理过程。

三种人脐静脉内皮细胞分离方法的比较

目的建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离和培养的方法。方法分别采取“灌注消化法”、“机械刮取法”和“灌注搓揉法”来分离HUVECs。通过苔盼蓝排斥法检测细胞活力并计数,进行免疫荧光法鉴定,比较这3种方法在获取的细胞数目、细胞活力和纯度方面的差异。常规进行细胞的原代培养和传代培养。取第3代培养细胞绘制细胞生长曲线,根据细胞生长特点,形态及表型特征对培养细胞进行鉴定。结果“灌注搓揉法”所分离的细胞无论从细胞数目、细胞活力和纯度方面均优于传统的“灌注消化法”和“机械刮取法”。培养的细胞从形态、生长特点和表型鉴定证实为血管内皮细胞(ECs)。结论“灌注搓揉法”是一种获取血管ECs成功率高,可靠的方法。

高渗氯化钠羟乙基淀粉40用于神经外科手术患者扩容的安全性

目的探讨高渗氯化钠羟乙基淀粉40(HH40)用于神经外科手术患者扩容的可行性,并观察其对血电解质和血流动力学的影响。方法ASAⅠ～Ⅱ级择期行神经外科手术患者60例,随机分为羟乙基淀粉溶液(200/0.5)组(A组,n=30)和HH40组(H组,n=30)。两组患者入室后均输注复方氯化钠溶液,手术开始时H组输注HH40液250mL,A组输注羟乙基淀粉溶液(200/0.5)500mL,两组液体均在1h内恒速输完。并分别于输注前(T0)、输注完毕后即刻(T1)、输注完毕后30min(T2)和60min(T3)4个时点监测MAP、HR、CVP和血电解质K+、Na+、Cl-的变化,并监测每小时出血量、输液量和尿量。结果3例患者在术中输注甘露醇,3例患者额外补充胶体液,均除外在本试验中。两组液体输注后MAP、HR、术中每小时出血量差异无统计学意义(P>0.05)。与T0时相比,H组T1～3CVP增加(P<0.05);T1～3血Na+浓度升高(P<0.05),以T2时升高最为明显(P<0.01),T1时血Cl-浓度升高(P<0.05),T2～3血Cl-浓度降低(P<0.01)。与T0时相比,A组T1～3CVP增加(P<0.05),T2时血Na+浓度升高(P<0.01);T2时血Cl-浓度降低(P<0.01);两组T2时血K+浓度均升高(P<0.05)。结论HH40液250mL在神经外科手术中扩容是安全有效的,可很好地维持血流动力学平稳。输入HH40后短暂升高Na+浓度,但不引起电解质紊乱。

siRNA沉默平滑肌细胞Cx43的表达及对细胞增殖的影响

目的通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默平滑肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达,观察其对平滑肌细胞增殖的影响。方法应用阳离子脂质体转染的方法,将化学合成的特异性378siRNA转染平滑肌细胞设为特异性siRNA组,并以转染非特异性siRNA和空白作为对照,半定量RT-PCR法分析转染不同时间(24、48、72、96 h)细胞Cx43 mRNA表达水平的变化;同时噻唑蓝(MTT)比色法检测平滑肌细胞增殖,观察转染不同浓度(50、100、1502、00 nmol/L)378siRNA对细胞增殖的影响。结果半定量RT-PCR结果显示与非特异性siRNA组及空白对照组相比,转染特异性378siRNA后Cx43 mRNA表达水平显著地下调并呈时间依赖性特点。MTT结果显示与空白对照组相比,转染低浓度(50 nmol/L)378siRNA早期(24、48 h)OD值开始降低,但差异无统计学意义(P>0.05),随着特异性siRNA浓度的升高,OD值显著降低(P<0.05)。200 nmol/L 378siRNA转染72、96 h对细胞的增殖抑制率分别为32.51%、42.67%(P<0.01),并呈浓度依赖性特点;而作为阴性对照的siRNA转染后则无上述作用。结论转染特异性378siRNA可有效沉默平滑肌细胞缝隙连接Cx43mRNA的表达并抑制平滑肌细胞的增殖。

妇科兼性厌氧菌的分离、培养及其致病性研究

目的对经临床确诊为慢性感染的女性下生殖道分泌液，进行厌氧菌分离、培养，并就其致病性进行研究。方法取20例经临床确诊为慢性宫颈炎、阴道炎、官腔感染、盆腔脓肿的病人阴道分泌物，经厌氧和有氧培养、分离，取对硝唑尼特高敏株进行鉴定，并接种于皮下注射环磷酰胺所致免疫力低下的小鼠阴道内。结果分离到兼性厌氧菌有10株，专性厌氧菌有4株；其中对硝唑尼特高敏1株．鉴定结果为E．coli大肠埃希氏菌；所有小鼠接种细菌后阴道分泌液明显增加，进行有氧和无氧培养有大量菌落形成，均为所接种的细菌；所有动物在接种细菌24～72h内，相继死亡；病理检查炎症表现明显。结论分离的兼性厌氧菌在免疫力低下的小鼠阴道内可造成感染。

胶质瘤转染Cx43cDNA与放疗的协同作用

目的探讨体外培养脑胶质瘤细胞转染Cx43cDNA与放疗是否存在协同作用及该作用与缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的关系。方法LipofectAMINE2000介导质粒DNA转染,G418筛选,半定量RT-PCR及划痕荷载染料传输试验鉴定。分别以MTT法及流式细胞仪检测C6、C6-Non、C6-Cx43细胞放疗组和未放疗组的细胞增殖率及凋亡率,进而观察转染Cx43基因与放疗杀伤胶质瘤细胞是否有协同作用。结果①C6-Cx43细胞Cx43mRNA表达显著增加,染料传输能力较C6-Non明显增强;②转染Cx43cDNA,上调C6细胞GJIC功能后,放疗对脑胶质瘤细胞的毒性作用明显增强。结论①转染Cx43cDNA可上调C6细胞GJIC。②GJIC功能上调后,放疗对脑胶质瘤细胞的毒性作用明显增强,转染Cx43cDNA与放疗存在协同作用。③缝隙连接细胞间通讯可能是肿瘤转染Cx43cDNA与放疗存在协同作用的机制之一。

染料木素磺酸钠对去卵巢大鼠甘油三酯和胆固醇代谢的调节作用

目的:通过去卵巢建立大鼠骨代谢与脂代谢紊乱动物模型,观察染料木素磺酸钠对去卵巢大鼠脂代谢的影响。方法:采用去卵巢方法建立大鼠骨代谢与脂代谢紊乱动物模型,选择SD雌鼠50只,随机分为5组:正常对照组、骨质疏松模型组、阳性药物组、低剂量GSS组(0.1 mg/kg)、高剂量GSS组(0.3 mg/kg)。建模1周后,分别灌胃给予生理盐水、戊酸雌二醇或不同浓度的染料木素磺酸钠治疗,每天一次。每周称体质量,测量体长,计算Lee's指数,6周后检测血清甘油三酯(TG)及胆固醇(CHO)含量。结果:(1)GSS组都能降低大鼠Lee's指数,0.3 mg/kg GSS组更为明显。(2)大鼠去卵巢后,TG及CHO均明显升高,GSS能降低TG及CHO含量,其中0.3 mg/kgGSS组效果更好。结论:染料木素磺酸钠可改善去卵巢大鼠脂代谢的紊乱。

转染Cx43cDNA对胶质瘤细胞生长影响的观察

背景与目的:缝隙连接与肿瘤的发生、发展、转移和凋亡密切相关。本研究观察转染Cx43cDNA对C6细胞缝隙连接细胞间通讯功能(gapjunctionalintercellularcommunication,GJIC)功能及生长影响情况。方法:①通过氯化钙法将质粒转入JM109菌株,筛选阳性菌落扩增,用WizardPureFection质粒DNA纯化系统试剂盒进行提取及纯化,最后用EcorⅠ、HindⅢ内切酶进行酶切鉴定;②基因转染:通过LipofectAMINE2000介导对C6细胞进行质粒DNA转染,用G418筛选浓度筛选出转染成功细胞;③用半定量RT-PCR检测转染后C6细胞Cx43mRNA表达的改变;④划痕荷载染料传输实验(scrapeloadingdyetransfertest,SLDT)检测转染前后GJIC的改变;⑤以MTT法检测转染细胞培养72h后的A值,观察转染Cx43cDNA对C6细胞生长抑制情况;⑥用流式细胞仪技术检测转染细胞培养72h后细胞凋亡率,观察转染Cx43cDNA对C6细胞凋亡的影响。结果:①转染了Cx43cDNA的C6-Cx43细胞Cx43mRNA表达显著增加;②C6-Cx43细胞染料传输能力较空载质粒转染细胞C6-Non明显增强;③MTT法检测表明同C6-Non相比,C6-Cx43细胞A值较低,两者差异有显著性(P<0.01);④流式细胞仪检测发现C6-Cx43与C6-Non细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05)。结论:①转染Cx43cDNA可上调C6细胞GJIC水平。②转染Cx43cDNA可显著抑制C6细胞生长,但细胞凋亡并未增加。

LPS预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨14-3-3γ基因在LPS预处理对抗心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用。方法构建pSU-PER/14-3-3γRNA干扰重组质粒,转染入心肌细胞,分为5组:对照组、A/R组、LPS+A/R组、pSUPER+LPS+A/R组、pSUPER/14-3-3γ+LPS+A/R组。Western blot检测14-3-3γ蛋白表达,生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果 A/R损伤使细胞存活率下降,LDH升高,细胞凋亡增加,mPTP开放;LPS预处理可使14-3-3γ表达明显增加,通过抑制mPTP开放,对A/R损伤的细胞有保护作用;pSUPER/14-3-3γRNA干扰重组质粒通过抑制14-3-3γ蛋白表达,取消LPS预处理的保护作用。结论 LPS预处理可对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤,其机制与上调14-3-3γ,从而抑制mPTP开放有关。

福辛普利拉对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨福辛普利拉对培养乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用。方法取SD新生大鼠（1～3d）120只，培养成心肌细胞，在培养的第4d随机分为5组（每次取20只，每组重复6次）：正常对照组、缺氧／复氧（A／R）组、福辛普利拉剂量1＋A／R（F1＋A／R）组、福辛普利拉剂量2＋A／R（F2＋A／R）组、福辛普利拉剂量3＋A／R（F3＋A／R）组。建立缺氧／复氧损伤模型，以福辛普利拉进行干预，对各组分别观察心肌细胞搏动频率、细胞存活率和培养液中乳酸脱氢酶活性。结果①细胞搏动频率（beat／min）：A／R组（11．50±3．39）比正常对照组（99．83±4．22）明显减低（P〈0．01）；福辛普利拉各剂量组比A／R组显著加快（P〈0．01），比正常对照组稍慢，但无显著性差异（P〉0．05）。②细胞存活率：A／R（26．78±4．25％）组比正常对照组（87．96±2．58）明显降低（P〈0．01）；福辛普利拉各剂量组比A／R组明显增高（P〈0．01），与正常对照组相比无显著性差异（P〉0．05）。③LDH活性：A／R组（69．50±7．34）比正常对照组（10．33±2．73）明显升高（P〈0．01）；福辛普利拉各剂量组比A／R组明显降低（P〈0．01），与正常对照组相比虽有升高但无显著性差异（P〉0．05）。结论从细胞水平证实福辛普利拉预处理对心肌细胞对缺氧／复氧损伤具有保护作用。

消炎合剂治疗慢性前列腺炎的实验研究

目的探讨消炎合剂治疗慢性前列腺炎的药理作用及机制。方法以致炎动物大鼠和致血瘀动物兔为动物模型,观察消炎合剂抗炎和改善微循环的作用。结果消炎合剂能明显降低实验性大鼠炎症模型前列腺液中的白细胞数,什高卵磷脂小体密度,抑制纤维母细胞增生和炎细胞浸润,减轻腺体增生,增加和改善实验性兔瘀血模型微循环的血管管径,管径截面积,平均血流速度、平均血流量等,提示消炎合剂具有抗炎和改善微循环的作用。结论消炎合剂有显著抑制实验性慢性前列腺炎的作用。

黄精多糖预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的研究黄精多糖（Polygona-Polysaccharose,PSP）预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（anoxia/reoxygen-ation,A/R）损伤的保护作用及与其抗氧化作用的关系。方法实验用SD新生大鼠（出生1~3 d）20只,雌雄不拘,常规方法培养心肌细胞,在培养48 h后按随机数字表法分为4组（每组重复实验6次）：正常对照组（Control组）、A/R组、缺氧预处理（anoxia preconditioning,APC）组（APC＋AR组,3次短暂缺氧复氧,再进行A/R操作）、PSP预处理组（PSP＋A/R组）。对以下指标进行检测：细胞存活率（MTT法）,培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性;心肌细胞凋亡率（流式细胞仪）。结果与对照组比较,A/R组心肌细胞存活率、细胞培养液中SOD活性均明显降低（均P〈0.01）,而细胞培养液中MDA含量、LDH活性及心肌细胞凋亡率均明显增加（均P〈0.01）。与A/R组比较,APC＋A/R组与PSP＋A/R组心肌细胞存活率、细胞培养液中SOD活性均明显增加（均P〈0.01）,同时细胞培养液中MDA含量、LDH活性及心肌细胞凋亡率均明显降低（均P〈0.01）。与APC＋A/R组比较,PSP＋A/R组心肌细胞存活率、细胞培养液中MDA含量及LDH、SOD活性和心肌细胞凋亡率差异均无统计学意义（均P〉0.05）。结论 PSP预处理可减轻心肌细胞A/R损伤,具有模拟APC作用,其机制可能与PSP的抗氧化作用有关。

防治血管再狭窄的新靶点——缝隙连接蛋白43

缝隙连接是介导相邻细胞间离子和小分子信号物质直接交换的跨膜通道,血管平滑肌细胞中主要表达连接蛋白43(connexin43,CX43)。研究表明,CX43表达上调与平滑肌细胞的增殖、迁移及细胞外基质生成密切相关,促使血管损伤后新内膜生成,引起血管再狭窄,提示CX43可能成为血管性疾病治疗的新靶点。本文综述CX43与血管再狭窄之间关系及以CX43为靶点的药物和基因治疗的研究进展。

表没食子儿茶素没食子酸酯预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤保护及相关机制的研究

目的建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤模型,探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及相关机制。方法分离培养SD乳鼠心肌细胞,心肌细胞在培养48h后随机分为3组(每次取18只乳鼠,每组实验重复6次):正常对照组、A/R组、EGCG预处理组(EGCG+A/R组)。采用MTT比色法测定各组心肌细胞存活率,比色法测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,黄嘌呤氧化酶法测定各组心肌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的含量,硫代巴比妥酸法测定各组心肌细胞内丙二醛(MDA)的含量,流式细胞分析仪检测各组心肌细胞内活性氧(ROS)的含量。结果与对照组比较,A/R组心肌细胞存活率、细胞内SOD含量均明显降低(均P<0.01),而心肌细胞内MDA、ROS以及细胞释放的LDH均明显增加(均P<0.01)。与A/R组比较,EGCG+A/R组心肌细胞存活率、细胞内SOD含量均明显增加(均P<0.01),同时心肌细胞内MDA、ROS及细胞释放的LDH均明显降低(均P<0.01)。结论EGCG预处理可减轻心肌细胞A/R损伤,其机制可能为EGCG增加了细胞的内源性抗氧化剂活性,降低心肌细胞A/R后氧自由基的生成。