自发性高血压大鼠年龄相关性左心室肥厚的动态变化

目的观测不同年龄自发性高血压大鼠(SHR)左室肥厚的动态改变。方法选择SPF级4周龄雄性京都种Wistar大鼠(WKY)35只及SHR 45只,连续饲养观测至42周,分别于6、8、12、18、24、32和42周超声心动图监测心脏结构与功能,尾套法监测收缩压,测定左室质量指数(LVMI),HE染色观察左室组织病理形态,RT⁃qPCR检测左室组织肥厚相关基因ANP和β⁃MHC。结果6至12周SHR收缩压快速升高,12周时较WKY大鼠显著升高(P<0.05),随后SHR血压呈小幅缓慢上升。伴随年龄及血压改变,SHR左室肥厚逐步形成并持续发展,相关肥厚指标室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、心肌细胞横径(TDM)及LVMI均呈现特征性动态变化。SHR肥厚相关基因ANP和β⁃MHC表达也呈年龄及血压依赖性动态改变。结论SHR左室肥厚伴随年龄及血压改变呈特征性动态变化。

白藜芦醇对抗线粒体电压依赖性阴离子通道介导心肌损伤作用的研究

目的从细胞水平探讨白藜芦醇抗心肌损伤保护作用机制,明确其与线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)的关系。方法以pFLAG质粒为载体,构建VDAC1真核表达载体pFLAG-VDAC1。H9c2心肌细胞随机分为5组,Control组、缺氧/复氧(A/R)组、白藜芦醇组、pFLAG-VDAC1-白藜芦醇组和pFLAG-白藜芦醇组。Western blot法测定VDAC1的蛋白表达,MTT法检测细胞存活率,生化自动分析仪测定LDH、CPK活性,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔道(mPTP)的开放。结果 A/R处理后,VDAC1表达上调,细胞存活率下降,LDH和CPK活性增高,mPTP开放;而白藜芦醇则能抑制VDAC1的上调,并降低mPTP开放程度,对抗A/R损伤;但VDAC1高表达的pFLAG-VDAC1-白藜芦醇组则可取消白藜芦醇的心肌保护作用。结论白藜芦醇抗A/R损伤作用与VDAC1密切相关,其可通过下调VDAC1从而防止mPTP的开放,保护心肌细胞。

五甲基槲皮素预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的机制研究

目的:探讨五甲基槲皮素(PMQ)预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其线粒体功能的影响。方法:原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,经终浓度分别为10、30、100μmol/L PMQ预处理24h后,制作A/R损伤,检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、MTT法检测细胞存活率、流式细胞法检测线粒体膜电位和细胞凋亡情况、线粒体肿胀法检测各组心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)开放情况。结果:不同剂量PMQ(10、30、100μmol/L)预处理24h后可剂量依赖性地降低LDH活性、增加细胞存活率、减少细胞凋亡(P<0.05或P<0.01);30、100μmol/L PMQ预处理24h后,线粒体膜电位更为稳定、mPTP开放减少(P<0.05或P<0.01)。结论:PMQ预处理24h后,可产生药理性延迟保护作用,机制与其稳定线粒体膜电位、抑制mPTP开放,进而减少细胞凋亡有关。

原发性高血压左室肥厚患者循环miRNA的高通量测序分析

目的:探讨原发性高血压左室肥厚患者循环miRNA的特异性表达,为高血压左室肥厚的诊断和预测寻找新的候选生物学标志。方法:入选原发性高血压合并左室肥厚及原发性高血压不合并左室肥厚患者各5例,采集患者血浆标本并进行miRNA提取,通过高通量二代测序技术检测两组患者循环miRNA表达变化,对测序数据进行分析筛选出差异性表达miRNA,进一步通过生物信息学分析差异表达miRNA的靶基因并进行功能富集分析,初步探讨差异表达miRNA的功能。结果:筛选出原发性高血压左室肥厚患者差异化特异性表达miRNA共64个,其中表达上调的35个,表达下调的29个。生物信息学分析显示差异性表达miRNA的功能主要涉及心肌细胞肾上腺素信号、神经活化配体/受体相互作用、免疫炎症反应、脂肪酸代谢等与高血压左室肥厚密切相关信号通路的调控。变化差异最大的10个miRNA中,hsa-mir-100、hsa-mir-202、hsa-mir-181a-2、hsa-mir-450b富集的功能最为显著。结论:原发性高血压左室肥厚患者外周循环中存在特异性miRNA表达谱,可为原发性高血压左室肥厚的诊断和预测提供候选生物学标志。

microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中Notch信号分子的表达变化

目的探讨微小RNA-1对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响及分化过程中Notch信号分子的表达变化。方法全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠MSCs并进行流式细胞学鉴定,miR-1慢病毒载体感染大鼠MSCs(MSCsmiR-1)按培养时间将细胞分成4组:对照组、培养4、6和15 d组;光镜下观察细胞形态变化,q PCR检测miR-1及心肌细胞特异性基因GATA-4、c Tn I、α-actin表达,免疫荧光检测c Tn I表达,Western blot检测α-actin表达;q PCR检测Notch信号通路相关基因的表达变化。结果原代大鼠MSCs呈长梭形、漩涡状生长,98%以上细胞表达CD44和CD29,不足1%的细胞表达CD45。MSCsmiR-1中miR-1表达水平持续上升,同时伴随心肌特异性基因GATA-4、c Tn I和α-actin的表达逐渐增强,感染4 d后可见c Tn I在部分MSCsmiR-1中表达,同时可检测到α-actin在MSCsmiR-1中表达;MSCsmiR-1向心肌样细胞分化过程中,Notch信号分子Jagged1、Notch1、Notch3和Hey2表达水平逐渐下调,于15 d时下调幅度最大。结论传导miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌样细胞的分化;且分化过程中伴随着Notch信号分子Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2表达水平下调。

微小核糖核酸-31对大肿瘤抑制因子2及心肌细胞肥大的调控作用

目的:通过下调肥大心肌细胞中微小核糖核酸(miR)-31的表达,观察miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)及心肌细胞肥大的调控作用。方法:体外分离大鼠心肌细胞并连续培养10天,按干预条件不同将心肌细胞分为4组:空白对照组、单纯血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预组、miR-31抑制物慢病毒感染组、阴性病毒感染组。培养第8天实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组心肌细胞miR-31、LATS2及肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)表达。培养第10天心肌细胞荧光探针染色观察心肌细胞形态变化。蛋白免疫印迹(Western blot)检测LATS2蛋白表达变化。双荧光素酶报告基因质粒转染293T细胞并检测荧光素酶活性,鉴定miR-3l对LATS2的靶向作用。结果:与空白对照组相比,单纯AngⅡ干预组miR-31、心肌肥大基因ANP、β-MHC表达水平均显著上升(P<0.05),心肌细胞相对表面积明显增大(P<0.05),而LATS2基因及蛋白表达明显下调(P<0.05);与单纯AngⅡ干预组比较,miR-31抑制物慢病毒感染组miR-31、心肌肥大基因ANP、β-MHC表达明显下调(P<0.05),心肌细胞相对表面积减小(P<0.05),而LATS2在基因水平略有上升,蛋白水平则显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测显示TRAF6-3'UTR+miR-146b相对荧光素酶活性较TRAF6-3'UTR+miR-NC显著性下降(P<0.01),LATS2-3'UTR+miR-31相对荧光素酶活性较LATS2-3'UTR-NC+miR-31显著性降低(P<0.01),差异均有统计学意义。结论:下调肥大心肌细胞miR-31表达水平可一定程度逆转心肌细胞肥大,miR-31靶向作用LATS2参与调控心肌细胞的肥大。

miR-31及其靶基因LATS2在大鼠肥大心肌细胞中的表达

目的观察大鼠心肌细胞肥大过程中miR-31及其靶基因LATS2的表达变化。方法构建双荧光素酶基因报告系统鉴定miR-3l对LATS2的靶向作用。体外培养原代大鼠心肌细胞,给予10-6mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激构建体外心肌细胞肥大模型,RT-q PCR检测miR-31、LATS2及心肌肥大基因ANP与β-MHC表达,心肌细胞F肌动蛋白荧光探针染色观察心肌细胞形态变化,Western blot进一步检测LATS2蛋白表达。结果 miR-3l可与LATS2-3'UTR基因片段特异性结合并使荧光素酶活性显著降低。10-6mol/L AngⅡ干预48 h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP及β-MHC表达上调(P<0.01和P<0.05),干预96 h后心肌细胞表面积明显增大。伴随心肌细胞的肥大变化,miR-31表达显著上调(P<0.01),LATS2在基因及蛋白水平均明显下调(P<0.05)。结论伴随大鼠心肌细胞的肥大变化,miR-31表达显著上调,而LATS2在基因及蛋白水平均明显下调。

AEs蛋白在心肌细胞急性损伤与保护的差异性表达

以原代培养的SD新生乳鼠心肌细胞为研究对象,建立缺氧/复氧(A/R)损伤和缺氧预适应(APC)保护模型。通过RT-PCR法和Western blot法检测阴离子交换蛋白(AEs)各亚型AE1、AE2和AE3在A/R损伤与APC保护中表达是否存在差异。结果发现,A/R损伤后AE2表达增加,APC可抑制其增加;但AE1和AE3经APC处理后,表达却明显上调;提示:AE2可能参与心肌细胞A/R损伤,AE1和AE3则可能参与了心肌细胞APC的保护作用。

川芎嗪预处理对大鼠无创肢体缺血预适应心肌保护作用的影响

目的:探讨川芎嗪(TMP)预处理对大鼠无创肢体缺血预适应(R-IPC)心肌保护作用的影响。方法:取成年雄性SD大鼠40只,随机均分为5组,分别为对照(Cont)组、缺血/再灌注(I/R)组、R-IPC组、TMP组、R-IPC+TMP组。预处理时R-IPC组和R-IPC+TMP组每天R-IPC预处理1次,连续3d;TMP组和R-IPC+TMP组每天i.p.TMP 10mg/kg预处理1次,连续3d;末次预处理24h后,制备Langendorff逆灌离体心脏并作I/R损伤模型;检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)活性,心肌梗死面积,心肌组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、caspase-3活性,细胞凋亡情况。结果:R-IPC或TMP预处理24h后,大鼠心脏可有效对抗急性I/R损伤性的冠脉流出液中LDH、CPK活性以及梗死面积的增加,心肌组织中MDA含量上升和SOD、GSH-Px活性降低以及caspase-3活性和凋亡指数增加(P<0.01),表现出延迟保护作用;R-IPC与TMP共同预处理24h后,诱发的延迟保护作用--在LDH、CPK活性与梗死面积等指标上,二者间表现为相互协同作用稍逊于SOD、GSH-Px、caspase-3活性和凋亡指数等指标。结论:TMP预处理可有效增强R-IPC对大鼠心脏急性I/R损伤之延迟保护作用。

双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响。方法运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3′UTR(LATS2-3′UTR-WT)及突变型3′UTR(LATS2-3′UTR-MU)片段,构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化。结果Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3′UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3′UTR-MU+miR-31组相比,LATS2-3′UTR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03vs.1.00±0.03,P>0.05),而LATS2-3′UTR-MT+miR-31组与LATS2-3′UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02vs.1.00±0.03,P<0.01);AngⅡ诱导48h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P<0.01)及β-MHC表达上调(P<0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P<0.01),LATS2基因明显下调(P<0.05),96h后心肌细胞表面积明显增大。结论miR-31可通过与LATS2基因3′UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大。