mFVII／Fc融合基因慢病毒载体的构建及在hBMSCs中表达的研究

目的构建人凝血因子VII（FVII）与免疫球蛋白Fc片段融合基因（mFVII／Fc）的慢病毒表达载体，并检测其在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）中的表达情况，获取mFvII／Fc稳定表达的干细胞载体。方法体外克隆人凝血因子VII，用点突变技术在基因水平将341部位Lys突变为Ala后，利用DNA连接酶与免疫球蛋白IgG1 Fc片段的基因融合，经酶切整合，测序鉴定后转染人胚肾293T细胞包装为重组mFVII／Fc慢病毒载体，鉴定载体构建成功后，测定慢病毒滴度。确定转染第三代hBMSCs的最佳MOI值后批量转染，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，RT—PCR、ELISA分别在不同时间点对mFVII／Fc的mRNA及蛋白表达进行相对定量分析。结果所构建融合基因与GenBankID：AF272774对比，除同义变异外完全相符；包装的慢病毒滴度为2×10^8TU／ml；hBMSCs鉴定结果为CD＋（98．08％）、CD＋（97．63％）、CD；（0．31％）、CD＋（0．58％）；转染hBMSCs72h后的效率为（84±3）％，经RT—PCR及ELISA证实转染mFVII／Fc基因的hBMSCs有大量mRNA转录和蛋白表达水平。结论实验成功获得了融合基因的hBMSCs稳定遗传表达载体，为靶向前列腺癌组织因子研究及肿瘤基因治疗研究提供了实验依据。