构建人热休克蛋白22基因真核表达载体pEGFP-N1／HSP22及在血管内皮细胞中的表达

背景:已有实验证实,人热休克蛋白22(Heat shock protein22,HSP22)存在于人的多种组织中,但构建其真核表达质粒是否可转染人血管内皮细胞并完整表达。目的:构建pEGFP-N1/HSP22真核表达质粒并观察在内皮细胞中的表达。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-03/10在南昌大学第二附属医院分子中心完成。材料:pEGFP-N1真核表达质粒及DH5α为南昌大学第二附属医院分子中心保存,MCF-7细胞来源于南昌大学生化实验室馈赠,人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)株购至南京基凯生物技术公司。方法:采用反转录聚合酶链式反应从人MCF-7细胞中扩增热休克蛋白22基因,将热休克蛋白22基因连接到真核表达载体pEGFP-N1中,并转化DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。用脂质体法将重组质粒转染人脐静脉血管内皮细胞。主要观察指标:荧光显微镜、反转录-聚合酶链反应法及Western blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。结果:①琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链反应扩增产物,热休克蛋白22基因片段长约613bp,与预期分子量相符,测序结果证实克隆完全正确;其阳性克隆进行酶切鉴定与热休克蛋白22理论值相符。②反转录-聚合酶链反应法检测转染的人脐静脉血管内皮细胞中有热休克蛋白22mRNA表达;Western blot检测可见一特异性热休克蛋白22蛋白条带存在。结论:成功构建了携带人热休克蛋白22及pEGFP-N1真核表达质粒,并验证已在人脐静脉血管内皮细胞中表达。

热休克蛋白22与心肌保护

热休克蛋白22是小分子热休克蛋白亚家族中的成员之一,广泛分布于哺乳动物的各种组织中,如心脏和骨骼肌等,分子量为21.6kD。近来研究发现,热休克蛋白22可通过促进细胞存活,抑制细胞凋亡,参与糖代谢及分子伴侣样作用,对缺血缺氧等应激损伤的心肌细胞具有显著保护作用。

热休克蛋白22在内皮损伤致动脉粥样硬化中的作用

热休克蛋白22（heat shock protein22，HSP22）是新近在果蝇唾液腺中发现的蛋白，属于小分子热休克蛋白（sHSP）超家族成员，又称HSPB8和H11。大量研究表明，缺血缺氧、再灌注损伤、心肌冬眠和压力负荷损伤心肌时，HSP22可激活细胞内AMPK、P13K／Akt、PKC、iNOS、mTOR等通路，对各种应激损伤发挥保护作用。近年来研究发现，不良应激时，HSP22表达于血管内皮细胞并可能发挥一定保护作用，内皮细胞是动脉内膜的第一层屏障，保护血管壁免受有害物质侵袭，动脉粥样硬化是一种以内膜损伤为起始病变的血管性疾病，以上提示HSP22可能在内皮损伤致动脉粥样硬化中发挥一定的作用。本文就HSP22在损伤内皮中的相关作用作一综述。

稳定表达人热休克蛋白22内皮细胞株的构建和鉴定

背景:热休克蛋白22的应激表达可能对缺氧复氧内皮具有一定的保护作用。目的:建立稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。方法:EcoRⅠ/kpnⅠ双酶切鉴定真核表达重组质粒pEGFP-N1-HSP22。脂质体法以重组质粒pEGFP-N1-HSP22转染人脐静脉内皮细胞,G418筛选,获得G418抗性单克隆细胞。用荧光显微镜、RT-PCR及Western-blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。结果与结论:经双酶切电泳检测重组质粒pEGFP-N1-HSP22符合预期大小片段。稳定转染的单克隆人脐静脉内皮细胞中,荧光显微镜观察到每个细胞均有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western-blot检测到热休克蛋白22mRNA和蛋白表达。说明成功获得稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。