甲状腺功能亢进患者骨密度与血清骨代谢指标的变化及意义

目的观察甲状腺功能亢进(以下简称甲亢)患者骨密度及血清骨代谢指标的变化,为甲亢患者骨质疏松的早期诊断提供依据。方法选择甲亢患者65例作为甲亢组、健康体检者49例作为对照组。采用双能X线骨密度仪检测两组腰椎1~4(L_1~L_4)和股骨近端(股骨颈、Wards三角、大粗隆)的骨密度。采集两组空腹静脉血,检测血清骨代谢破骨细胞功能指标β胶原特殊序列(β-CTX)、Ⅰ型前胶原羧基末端前肽(PⅠNP)、N端骨钙素(N-MID)及间接反映破骨细胞活性的指标骨源性碱性磷酸酶(ABAP)水平。结果甲亢组L_1~L_4、股骨颈、Wards三角、大粗隆骨密度均低于对照组(P均<0.01),血清β-CTX、PⅠNP、N-MID及ABAP水平均高于对照组(P均<0.05)。甲亢患者血清PⅠNP、N-MID、β-CTX均与各部位骨密度呈负相关(P均<0.01)。结论甲亢患者多个部位的骨密度出现下降、血清骨代谢相关指标明显升高,且二者明显相关;动态观察血清骨代谢指标有助于早期发现甲亢所致的骨质疏松。

Bcl-2/Bad/mPTP通路介导14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤

目的探讨Bcl-2/Bad/mPTP通路在14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤中的作用。方法构建pFLAG-14-3-3γ重组质粒,转染至原代乳鼠心肌细胞中,然后行LPS损伤处理。处理结束后,取培养液检测LDH活性,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测mPTP开放,Western blot检测14-3-3γ、Bad、phospho-Bad以及线粒体Bcl-2蛋白表达。结果 LPS损伤使心肌细胞LDH活性升高、细胞存活率下降、凋亡细胞增加、mPTP开放加剧,转染pFLAG-14-3-3γ重组质粒后再行LPS损伤,则LDH活性下降、细胞存活率升高、mPTP开放与细胞凋亡减少,同时phospho-Bad蛋白表达增加,线粒体Bcl-2蛋白表达增加。结论 pFLAG-14-3-3γ能够对抗脂多糖所致的心肌细胞损伤,其机制可能与磷酸化Bad,释放Bcl-2至线粒体,抑制mPTP的开放有关。

胸腔积液中hTERT mRNACEA CA19-9检测及其意义

目的:探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、CEA、CA19-9在鉴别诊断良恶性胸腔积液的意义。方法:采用全自动化学发光法检测胸腔积液中CEA、CA19-9含量及RT-PCR检测胸腔积液中hTERT mRNA表达。结果:恶性组中hTERTmRNA、CEA、CA19-9阳性率显著高于良性组(P<0.05)。三者在恶性胸腔积液的敏感性(%)、特异性(%)和诊断符合率(%)分别为:hTERT mRNA:81.8/90.5/86.1,CEA:52.3/92.9/72.1,CA19-9:34.1/90.5/61.6。hTERT mRNA+CEA在恶性胸腔积液中诊断阳性率97.7%。结论:三者均有助于良恶性胸腔积液的鉴别诊断,而hTERT mRNA对于鉴别良恶性胸腔积液有更大的临床价值,CA19-9不宜作为首选指标;hTERT mRNA和CEA联合检测可以进一步提高恶性胸腔积液的阳性检出率,有助于提高其诊断价值。

eNOS参与铁过载诱导的血管内皮细胞线粒体损伤

目的探讨e NOS及ADMA/DDAHⅡ介导的铁过载对HUVECs细胞线粒体的损伤作用。方法常规培养HUVECs细胞,随机分为正常对照(Ctrl)组、右旋糖酐铁(Iron)组、L-精氨酸(L-Arg)组。48 h后,MTT法检测细胞存活率;HPLC法检测ADMA含量及DDAHⅡ活性;Western blot法检测e NOS表达;比色法检测培养液LDH活性、NO含量、细胞MDA含量以及m PTP开放;流式细胞仪检测心肌细胞ROS含量、线粒体膜电位及细胞凋亡。结果 Iron处理48 h后,HUVECs细胞存活率明显降低,培养液ADMA及LDH活性升高,NO含量减少;细胞e NOS表达下调、DDAHⅡ活性降低;MDA含量与ROS生成明显增加,线粒体膜电位减小,m PTP大量开放,细胞凋亡增加;ADMA生理性对抗剂L-Arg则可明显减弱Iron的上述损伤作用。结论 e NOS参与铁过载诱导的HUVECs细胞线粒体损伤,ADMA/DDAHⅡ机制也可能发挥了作用。

不同程度大鼠冻伤模型的构建

背景:冻伤目前尚无特异治疗方法,良好的冻伤模型对研究冻伤的机制及修复有重要意义。目的:建立大鼠不同程度皮肤冻伤模型,探讨建立理想冻伤模型的新方法。方法:将一元钱硬币在液氮罐中冷冻至-196℃后紧贴SD大鼠皮肤3,5,10s,24h后分别切取冻伤组织标本行常规苏木精-伊红染色,显微镜下观察组织的病理结构改变。结果与结论:冻伤3s所造成的轻度冻伤只破坏了表皮浅层,基底层未发生改变;冻伤5s所造成的中度冻伤破坏了表皮全层(含基底层)及真皮浅层,但真皮深层及毛囊根部未受损伤;冻伤10s所造成的重度冻伤破坏了真皮深层及毛囊根部。说明冻伤3s所造成的轻度冻伤和冻伤5s所造成的中度冻伤可作为依据建立动物模型。

无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

于2005-06/2007-09在南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室拟建立一种在无血清培养条件下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的方法。所用无血清培养基血清替代物是将纯化人转铁蛋白直接溶于DMEM培养基中,再将去毒后的BSA、超声波粉碎后的胆固醇、胰岛素及过氧化氢酶直接加入DMEM培养基中稀释至所需浓度。体外分离的脐血单个核细胞以1×109L-1接种,加入含氢化可的松、纤维连接蛋白的无血清培养基,7d后消化传代。取传至2,5,8代的脐血间充质干细胞,达60%～70%融合时以含β-巯基乙醇、丁化羟基苯甲醚的无血清培养基诱导其向神经细胞分化。结果在无血清条件下能培养扩增出大量脐血间充质干细胞,融合后可继续传代扩增;不表达CD34、CD13和CD45,强表达CD166、CD29、CD105,较强表达CD54,80%以上细胞处于G0/G1期;脐血间充质干细胞经诱导后,能形成具有典型神经元形态的神经细胞,神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经胶质元纤维酸性蛋白均呈阳性表达。提示在自行研制的无血清培养条件下可成功诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化。

miR-146a调控血小板免疫活化功能

目的探讨miR-146a对血小板免疫活化功能的影响。方法流式细胞术检测冠心病(n=31)及健康成年人(n=35)全血中血小板PAC-1、CD62-P阳性率,q-PCR及光比浊法分别检测血浆中miR-146a及血小板聚集率;培养K562细胞,佛波酯(PMA)诱导分化为巨核细胞后,分别转染miR-146a mimics、inhibitor及其阴性对照,Western blot检测转染后细胞中TLR-4、PAC-1及CD62-P表达水平。结果冠心病患者miR-146a、血小板聚集率及PAC-1、CD62-P阳性率较对照组升高(P<0.05);转染miR-146a mimics后,TLR-4、PAC-1和CD62-P表达水平升高(P<0.05)。结论miR-146a可能依赖血小板TLR-4信号通路,介导血小板免疫活化进而促进血小板聚集,加速血栓形成。

二烯丙基二硫化物对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨大蒜提取物二烯丙基二硫化物(DADS)对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用。方法取对数生长期的细胞,分别用0、20、50、100、200μmol/L的DADS处理24 h,用CCK-8法测算细胞生长抑制率。结果用20、50、100、200μmol/L的DADS处理24 h后,小鼠Lewis肺癌细胞生长抑制率分别为16.35%±0.40%、28.85%±0.70%、35.09%±0.50%、41.14%±1.10%,不同DADS药物浓度间比较,P均<0.01。结论 DADS呈浓度依赖性抑制Lewis肺癌细胞的增殖。

FAT10基因单体型与肝细胞癌的相关性研究

背景与目的:人类白细胞抗原FAT10是类泛素调节子蛋白家族中的一员,被认为与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展密切相关。本研究探讨FAT10基因单体型与肝细胞癌的关系。方法:收集254例肝癌病例和268例健康对照人群外周血标本,提取DNA,通过DNA测序分析方法,检测两组人群FAT10基因外显子和侧翼序列单核苷酸多态性。应用Haploview统计软件分析研究对象的连锁不平衡和单体型,并应用病例对照分析方法进行相关性研究。结果:在肝癌组和对照组FAT10基因外显子和侧翼序列上共检测到10个多态性位点。遗传不平衡发现-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G、+3809 G/T 9个SNPs在同一个单体型块,其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多态位点完全连锁。进一步选择-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3个tagSNPs进行关联分析和单体型构建,发现-143 A/G和+3476 T/C基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险(P<0.05)。进一步单体型分析发现ATT、ATC、GCT和ACT 4种单体型,其中肝癌患者的GCT和ACT单体型频率显著低于对照组(P<0.05),而ATT单体型频率显著高于对照组(P<0.05),经过1×108的随机置换检验校正后,ATT和GCT单体型与肝癌的发病风险仍然显著相关。结论:FAT10基因单体型可能与肝癌的发病风险相关,ATT单体型可能是肝癌的遗传标志。

解螺旋酶RecQ家族的研究进展

DNA解螺旋酶RecQ家族在抑制人类肿瘤发生及早衰方面发挥着重要作用。本文介绍了RecQ家族成员的结构与生物学特性,并在此基础上对其在DNA复制、重组、修复以及在维持端粒稳定方面的作用机制作一综述。

冻存前后脐带间充质干细胞生物学特性的比较

目的比较冻存对脐带间充质干细胞生物学特性的影响,为其更广泛的应用提供基础。方法实验于2009年至2010年在南昌大学第二附属医院分子医学实验室、血液病研究所完成。(1)实验材料:剖宫产胎儿脐带取自自愿捐献者,实验经医学伦理委员会批准。(2)采用胶原酶消化法从脐带中分离培养间充质干细胞。(3)将传至第3代的细胞冻存半年后复苏。(4)通过显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪检测细胞的表面标志,体外诱导分化为软骨及脂肪细胞检测其多向分化能力,比较复苏前后上述指标的差异。结果脐带经胶原酶消化法所获得的细胞培养至第3代细胞呈长梭形,排列有明显方向性,细胞排列成网状、辐射状,冻存复苏后期形态学无明显改变。培养至第3代的细胞高表达CD29、CD54、CD166,不表达CD13、CD34、CD45、CD31、HLA-DR,冻存复苏后的细胞表达与未冻存的细胞无统计学差异。MSC在体外分别向脂肪细胞及软骨细胞诱导分化,以油红O染色后可见染为红色的阳性细胞为脂肪细胞,经阿新兰染色后可见为蓝色的阳性细胞为软骨细胞,冻存复苏后的脐带间充质干细胞细胞也可向脂肪及软骨细胞分化。结论脐带作为一种新的MSC来源,可成为脐血和骨髓MSC的替代来源,并且冻存对MSC的生物学特性无明显改变,使其能更广泛地用于科研和临床前试验。

H19基因甲基化在Y染色体异常男性不育患者中的表达

目的探讨H19基因甲基化在Y染色体异常男性不育患者中的表达及相关性。方法用实时荧光PCR探针法检测33例Y染色体异常男性不育患者的微缺失。梯度离心法提取33例Y染色体异常标本,采用亚硫酸氢盐对精液DNA进行修饰,修饰后的DNA样本进行PCR扩增及纯化,产物与p MD@18-T载体连接并经酶切验证,挑选阳性克隆测序并对H19基因甲基化程度进行差异分析。结果基因微缺失检测结果显示,33例Y染色体异常患者包括3例AZFa区缺失患者、14例AZFc区缺失患者、1例AZFbc区缺失患者和15例无缺失患者。33例患者中18例Y染色体微缺失患者的H19基因呈低甲基化水平;15例无缺失患者中有7例呈高甲基化水平,其余8例为正常甲基化水平。结论 AZF缺失男性不育患者与H19基因异常甲基化有关,在精子的生成和成熟过程起到重要作用。

CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+检测在急性髓系白血病中的应用

目的探讨CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测与急性髓系白血病的发病机制、治疗效果及预后的关系,并与CD4+CD25+/CD4+法比较两种检测方法是否存在差异。方法应用流式细胞术法分别检测41例初治AML患者(初治组)、11例一次化疗缓解的患者(化疗敏感组)、9例两次以上化疗不缓解的患者(化疗耐药组)、13例化疗缓解后一直没有复发的患者(持续缓解组)、8例化疗缓解后又再次复发的患者(复发组)和20例健康体检者(对照组)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+在外周血中的比例。结果与对照组相比较,AML患者初治组两类细胞比例均较正常人明显升高(P<0.01),初治患者组两种检测方法间存在显著差异(P<0.01)。与化疗缓解组比较,化疗耐药组两种检测方法检测的比例均明显升高(P<0.01),耐药患者组两种方法间存在显著差异(P<0.01)。与持续缓解组比较,复发组患者的比例明显升高(P<0.01),复发组两种方法间存在显著差异(P<0.01)。结论急性髓系白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+与急性髓系白血病的发生相关,并且检测其比例能预测白血病患者对化疗药物的反应及预后,且其灵敏度高于CD4+CD25+/CD4+检测法,而其特异性与CD4+Foxp3+/CD4+检测法一致。

线粒体DNA母系遗传机制的研究进展

线粒体DNA一般只通过母系遗传，是人们探索母系遗传的绝佳工具。现简要地介绍线粒体DNA的遗传学特性及其为母系遗传的必然性，进而以对动物精子线粒体DNA在精子发生时及受精后发生降解的机制的阐述为基础，对国内外关于动物线粒体DNA母系遗传机制的研究进展作一综述。

非梗阻性肥厚型心肌病合并阻塞性睡眠呼吸暂停综合征致顽固性胸痛一例

本文报道一例表现为顽固性胸痛的非梗阻性肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）患者，该患者最终被诊断为同时合并阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS），经呼吸机治疗后胸痛缓解。

14-3-3γ对烧伤及LPS诱导所致大鼠心肌损伤的保护作用

目的:研究14-3-3γ在烧伤及脂多糖(LPS)引起的心肌损伤中的保护作用。方法:体内实验建立大鼠烧伤及LPS损伤模型,检测3、6、12、24 h各时点心功能及心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平的改变;体外实验采用新生大鼠心肌细胞,构建pFLAG-14-3-3γ质粒,于LPS损伤前24 h转染至心肌细胞,实验结束后检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果:烧伤及LPS损伤模型大鼠心电图ST段均有明显改变,心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平均显著升高。转染了pFLAG-14-3-3γ质粒的心肌细胞能明显对抗随后的LPS损伤,与未转染组比较,14-3-3γ能明显提高细胞存活率,降低LDH活性,减少细胞凋亡,抑制mPTP的开放。结论:14-3-3γ可能通过抑制mPTP的开放对烧伤及LPS所致的心肌损伤起保护作用。

首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒

目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达。方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成。①实验材料:含319bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存。②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53。以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5。③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性。运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达。利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况。结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段。②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P<0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显差异(P>0.05)。③RT-PCR和WesternBlot分别证实了p53mRNA和p53蛋白表达。④MTT检测到重组质粒对端粒酶阳性的大肠癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对端粒酶阴性的MRC-5细胞生长无明显影响(P<0.05)。⑤流式细胞检测观察到重组质粒引起端粒酶阳性的大肠癌细胞凋亡要明显强于端粒酶阴性的MRC-5细胞(P<0.05)。结论:构建的反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-EGFP在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达;重组反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-wtp53转染后对端粒酶阳性的大肠癌细胞有特异性的影响作用。

线粒体对iPSC再程序化的影响

iPS技术的出现为研究疾病的发病机制、药物筛选以及再生医学提供了新的途径。尽管iPS技术取得了迅速的发展,但对于iPS重编程过程目前仍不清楚。线粒体是细胞的多种生理过程的重要参与者,而其与iPS再程序化过程有什么联系,起到什么样的作用仍有待研究。

非小细胞肺癌EGFR、ALK、ROS1基因突变和临床病理特征分析

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)驱动基因突变与临床病理特征的关系。方法采用RT-PCR法检测NSCLC中EGFR、ALK、ROS1基因突变,并分析其与临床病理特征的关系。结果347例NSCLC中EGFR基因突变率为49.3%(171/347),突变易发生于女性、腺癌、年龄(≤62岁)及不吸烟患者(P<0.05),与有无淋巴结转移及肿瘤分期无关(P>0.05);突变类型以19-del和L858R为主(占87.1%)。ALK基因突变率为4.3%(15/347),ROS1基因突变率为1.7%(6/347),两基因突变均与患者性别、年龄、吸烟史、组织学类型、有无淋巴结转移及肿瘤分期无关(P>0.05),但ALK基因突变和ROS1基因突变者均为腺癌。另外,EGFR和ROS1基因突变共存者占0.3%(1/347)。结论NSCLC患者中EGFR基因突变率明显高于ALK及ROS1基因突变率。EGFR突变易发生于女性、腺癌、年龄≤62岁、不吸烟者,ALK和ROS1基因突变可能更易发生于腺癌患者。EGFR基因突变和ROS1基因突变可以共存。

非小细胞肺癌组织、血液及胸水EGFR基因突变分析

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的EGFR突变情况及血液和胸水标本"液体活检"的可行性。方法收集2015年1月～2017年12月南昌大学第二附属医院确诊为NSCLC患者的肿瘤组织、血液及胸水标本,利用突变扩增系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)检测EGFR的突变,并分析血液、胸水标本与配对肿瘤组织标本EGFR检测的一致性。结果组织标本EGFR突变率为49. 03%(330/673),突变主要发生于女性、腺癌及低于60岁患者中。与肿瘤组织相匹配的血液、胸水标本检测显示EGFR突变的一致性较好,Kappa值分别为0. 65、0. 82。结论 NSCLC患者EGFR的总突变率为49. 03%,女性、腺癌、低于60岁患者可能是EGFR突变的好发人群;血液、胸水标本中EGFR基因的检测与肿瘤组织标本相比具有较好的一致性;在肿瘤组织缺乏时,可以考虑采用血液、胸水标本进行EGFR基因检测。