组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究

目的利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤,探讨其用于修复动物皮肤缺损的可行性。方法将扩增的人表皮细胞复合异种(猪)脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤,将制备的人工皮肤移植于裸鼠全层皮肤缺损,观察创面愈合情况并进行直接免疫荧光鉴定。结果构建的组织工程皮肤可用于修复裸鼠全层皮肤缺损,创面愈合良好,新生的表皮由移植的人表皮细胞增殖形成。结论利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。

趋化因子2对血液肿瘤生物学行为的影响

肿瘤细胞与其生长微环境存在着交互作用,肿瘤微环境中的附属细胞可分泌一些可溶性因子影响肿瘤的进展,肿瘤细胞也可分泌一些细胞因子促进附属细胞的增殖和生长,因此对这些细胞因子的深入了解对于肿瘤发生发展机制的研究有重要意义。

应用表皮干细胞构建组织工程皮肤及移植实验

目的:探讨应用人表皮干细胞和猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法:实验于2004-06/2005-12在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①取环状切除后幼儿包皮(家属知情同意)用中性蛋白酶与胰蛋白酶混合消化液消化,收集细胞,接种在已包被Ⅳ型胶原的培养皿中,快速黏附,保留快速黏附细胞继续培养,培养体系为低钙高糖DMEM培养基,待融和状态时,再次消化,离心收集细胞,再次经过Ⅳ型胶原快速黏附,保留黏附细胞,培养20d左右,用作构建表皮干细胞并进行细胞鉴定。②将第2代细胞接种于铺好Ⅳ型胶原的猪无细胞真皮上,每3天换液。10d后将其转移至不锈钢网架上,行气液界面培养5d左右,构建复合皮。③取SD大鼠20只,随机分2组。于动物背部尾侧正中作2.5cm×2.5cm的全层皮肤至肌筋膜的切除。实验组10只创面覆盖表皮干细胞构建的复合皮移植物,对照组10只覆盖无细胞真皮移植物。④移植后7,10,14,21和35d,两组动物均活检取材,进行创面大体观察、组织学观察及免疫组织化学、免疫荧光鉴定等。结果:①表皮干细胞的分离、扩增及鉴定:在扩增的细胞拟接种于无细胞真皮前,进行角蛋白19免疫组织化学鉴定、以流式细胞术进行α6、CD71鉴定。经胶原Ⅳ黏附的细胞培养后形成较大集落,拟接种的种子细胞中α6briCD71dim细胞占总细胞的(39±7)%;鼠抗人角蛋白19阳性细胞率为(53±6)%。②组织工程皮肤的建立结果:表皮干细胞种植于无细胞真皮上1d后,细胞便贴壁并开始生长增殖,8d左右透过间隙见无细胞真皮上表皮干细胞渐增殖融合成片;2周时无细胞真皮表面可见菲薄皮片状生长的细胞膜片物。复合皮组织学检查可见无细胞真皮表面覆盖多层融合的表皮层细胞,无细胞真皮内细胞成分去除完全。③创面愈合情况:术后2周,实验组移植物成活,创面上已上皮化,移植物柔软,而对照组无细胞真皮表面未上皮化,较干燥,色暗、触之较硬,两组创面均未见明显收缩。4周,实验组创面愈合,未见明显排斥反应。对照组无细胞真皮干燥脱落而创面暴露,创面收缩明显,创面边缘因自体表皮细胞爬行而缩小创面。④组织学检查及免疫组织化学染色结果:实验组2周时创面已全部上皮化,但细胞分层少;3,4周表皮层分化良好,多层结构,真皮纤维内见成纤维细胞长入,见少许炎症细胞,大鼠自体正常皮肤见毛囊及毛发结构。对照组2周创面尚未上皮化,无细胞真皮干燥变性,3,4周后创面仍未愈合,可见大量炎症细胞。实验组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原直接免疫荧光染色呈阳性,证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成。而对照组阴性。实验组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色见整个表皮层细胞胞浆染呈棕黄,为阳性反应。结论:利用体外纯化扩增的表皮干细胞及制备的猪脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤,该组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。

葛根素对慢性心肌纤维化大鼠心脏功能和结缔组织生长因子的影响

目的研究葛根素对慢性心肌纤维化大鼠的心脏功能和心肌结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的影响。方法采用异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)5mg/kg·d×10d皮下注射制作大鼠慢性心肌纤维化模型,分早期和后期给予葛根素(100mg/kg·d)腹腔注射分别56d和46d。对48只雄性SD大鼠进行随机分组:造模组(M组)16只;对照组(C组)8只;早期干预组(Pa组)12只;后期治疗组(Pp组)12只。实验8周末对大鼠进行超声心动图检测左室射血分数(left ventricle ejection frac-tion,LVEF)及缩短分数(fractional shortening,FS),计算左心指数,进行VG(VanGieson)染色测算胶原容积积分(collagen volume fraction,CVF),RT-PCR检测CTGF mRNA水平。结果Pa组和Pp组的左心指数、CVF和CTGF均较M组明显减少(P<0.01),LVEF和FS则较M组明显增加(P<0.01);Pa组的左心指数和CTGF较Pp组明显减少(P<0.05),而CVF减少更为显著(P<0.01);Pa组的LVEF、FS则明显增加(P<0.01),其中Pa组的LVEF与C组无显著差异(P=0.075)。结论葛根素可抑制ISO诱导的心肌CTGF过表达,减少胶原沉积,从而改善心脏功能。

脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的作用

目的:骨髓间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应及丝裂原刺激的T细胞增殖,是通过自分泌转化生长因子发挥其免疫调节作用,而关于脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖作用的影响及其机制尚不清楚。实验拟观察验证脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的影响。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所、江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:健康产妇分娩后的脐带血及正常志愿者外周血各9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准。②实验方法:采脐血进行间充质干细胞的培养扩增,并经形态学、细胞表面分子测定及定向分化功能加以鉴定。将1.0×105,0.75×105,0.5×105,0.25×105,0.1×105,0.05×105,0.02×105,0.01×105的间充质干细胞加入到经植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,应用MTT法测定细胞增殖率,观察脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。应用ELISA法测定脐血间充质干细胞培养上清液中转化生长因子β1水平。结果:①不同数量脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖均有抑制作用,抑制作用在一定范围内呈细胞剂量依赖性,以淋巴细胞:间充质干细胞为1:0.75时抑制作用最强。②转化生长因子β1水平与脐血间充质干细胞数量有关,随着间充质干细胞数量增多,转化生长因子β1水平渐增高。③将脐带血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率与转化生长因子β1水平进行相关性分析,两者间存在明显相关性(r=0.85)。结论:①脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖有抑制作用,在一定范围内呈细胞剂量依赖性。②脐血间充质干细胞所分泌的转化生长因子β1含量与脐带血间充质干细胞数量呈正相关性。

PRAME与WT1基因在急性白血病患者中的表达及临床意义

目的探讨急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)PRAME(preferentially expressed antigen ofmelanoma)与WT1(Wil ms’tumor)基因的表达及临床意义。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测54例AL患者PRAME mRNA和WT1 mRNA的表达水平,并将两者检测结果进行比较。结果PRAME阳性表达率:ANLL为41.9%,ALL为38.5%,两组比较无显著性差异(P>0.05);WT1阳性表达率:ANLL为48.4%,ALL为46.2%,两组比较无显著性差异(P>0.05);而完全缓解组(complete remission,CR)及对照组PRAME和WT1的表达均阴性;有效组PRAME和WT1的表达水平显著低于无效组(P<0.01);对1例PRAME阳性和10例PRAME、WT1均阳性的患者进行随访,7例经化疗后PRAME表达水平不降,4例复发患者PRAME再次升高均早于临床复发,其中2例WT1的波动与PRAME同步,2例临床复发时才升高。结论与WT1基因一样,PRAME基因是急性白血病的一个重要标记基因,动态检测PRAME的表达水平可在一定程度上了解疾病的状态和体内白血病细胞的总负荷量,对AL患者的化学治疗、预后判断及监测微小残留病灶、防治复发有一定的意义。

白血病细胞源树突状细胞功能测定

目的:观察体外诱导的白血病细胞源树突状细胞(DC)的抗原递呈功能。方法:分离初诊8例急性髓细胞性白血病(AML)、9例慢性髓细胞性白血病(CML)患者和6例正常人的骨髓单个核细胞,用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养。分别于培养第1、6、14天用倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞术检测免疫学表型,用混合淋巴细胞反应检测抗原递呈功能。结果:经诱导培养,AML,CML和正常组骨髓单个核细胞均出现DC典型形态的细胞,而且免疫标记差异无统计学意义(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示,AML-DC、CML-DC和正常DC诱导生成的细胞毒T淋巴细胞(CTL)能够杀灭白血病细胞,AML-DC、CML-DC之间刺激T细胞增殖的能力相似(P>0.05),但2者刺激T细胞增殖的能力均低于正常DC(P<0.05)。结论:急性和慢性白血病细胞均能诱导分化成DC,但其抗原递呈功能较弱。

基质金属蛋白酶在间充质干细胞分化中的作用

基质金属蛋白酶参与了众多生长发育和疾病的相关过程,是影响许多生理学和病理学机制的关键因素。文章详细阐述了基质金属蛋白酶在间充质干细胞分化为成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、神经细胞、脂肪细胞过程中所起的重要生物学作用,并对基质金属蛋白酶在间充质干细胞分化中的调控作用进行分析。

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

目的拟建立人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系。方法将干细胞分别置于Knockout培养基(第1组)、自制无血清培养基(第2组)和添加bFGF及肝素的改良无血清培养基(第3组)中培养25代后观察比较3组干细胞形态学变化、克隆数目及大小。并借助细胞免疫组化、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测干细胞的未分化状态和全能性。结果传代25次后,第2组克隆逐渐分化。第1组和第3组的干细胞均呈典型的人胚胎干细胞形态特征;细胞表达Nanog,Oct-4,Tra-1-60,SSEA-4,但不表达SSEA-1;流式检测也显示SSEA-4高表达,SSEA-1低表达;体外分化能形成拟胚体。通过单位视野下克隆个数及大小的比较,结果显示第2组与第1组和第3组间的差异显著。结论本研究通过改良本实验室已获得国家专利的无血清培养基,初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系,培养效果与公认培养体系无明显差异。

脂质体RNA负载慢性粒细胞白血病来源树突状细胞的性能比较

目的研究人慢性粒细胞白血病(CML)总RNA经过脂质体负载后体外转染自体慢性粒细胞白血病-树突状细胞(CML-DC),并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫反应。方法采用Trizol法提取CML-BMMNC的总RNA;反复冻融法制备CML-BMMNC抗原。于CML-DC培养第5天,加入脂质体转染的CML总RNA、CML总RNA、CML肿瘤冻融抗原及不加抗原。倒置显微镜观察DC形态学变化;流式细胞仪器检测免疫表型变化;染色体G显带技术检测其染色体核型及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bcr-abl融合基因的表达;用MTT法检测CTL作用。结果CML BMMNC诱导成CML-DC,CD1α、CD83表型表达较诱导前明显上调,形态学有典型的DC形态,且均存在Bcr-abl基因带和Ph1染色体,提示CML-DC为白血病源性。总RNA经脂质体转染CML-DC、CML肿瘤冻融抗原负载CML-DC、总RNA不经脂质体转染CML-DC、未负载抗原CML-DC分别致敏的CTL及IL-2培养的T淋巴细胞在效:靶比为20∶1时的杀伤效率依次降低。结论CML BMMNC来源的DC既具有CML白血病源性,又具有DC细胞的特性,能诱导特异性CTL杀伤作用;总RNA经脂质体转染的CML-DC诱导的CTL杀伤性对CML细胞的杀伤作用最强。

以表皮细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤

目的体外扩增培养表皮细胞,复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤,以促进其进一步临床应用。方法将人表皮细胞进行体外培养扩增后,以生长良好的表皮细胞接种于制备好的异种(猪)无细胞真皮支架上,行气液界面联合体外培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及复合皮结构。结果培养的表皮细胞扩增良好,脱细胞真皮支架去细胞完全,表皮细胞在脱细胞真皮上可以生长,可体外构建复合皮肤。结论利用体外扩增的表皮细胞及制备的脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤。

骨髓血管微环境对造血干细胞“干性”的维持作用

造血微环境是造血干细胞(HSCs)赖以生存的"肥沃土壤",已证实骨髓血管组织中的内皮细胞和血管周围细胞是培育和维持HSCs的关键部位,彰显了骨髓血管微环境对HSCs调控的必要性。

小鼠Oct4基因克隆及其真核表达载体的构建

背景:Oct4是第一个被发现只在多能细胞中表达的转录因子,其功能被认为是控制细胞多能性的决定性因素。Oct4的这种作用机制目前并未明确。目的:克隆小鼠Oct4基因,构建其真核表达载体pEGFP-N2-Oct4。设计、时间及地点:单一样本研究,于2007-06/09在江西省分子医学重点实验室完成。材料:TRIzolReagent由MolecularRearchCenterInc提供;真核表达质粒载体pEGFP-N2由南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室提供。方法:用TRIzolReagent提取小鼠胚胎干细胞总RNA,并经反转录-聚合酶链反应获得小鼠Oct4DNA,将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N2上,以构建重组质粒pEGFP-N2-Oct4。主要观察指标:总RNA鉴定结果,RT-PCR扩增产物小鼠Oct4分子质量的鉴定结果,重组表达载体的酶切鉴定结果,克隆质粒的测序结果。结果:获取小鼠胚胎干细胞Oct4基因的全序列cDNA。构建Oct4cDNA真核表达质粒时,将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N2-Oct4成功,将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因的3'端,即保留了Oct4的生物学活性,又便于在研究Oct4生物学功能实验中可检测到蛋白表达。

异基因造血干细胞移植后实时定量聚合酶链反应在巨细胞病毒感染诊断和治疗中的应用

目的探讨异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后应用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）技术检测血浆巨细胞病毒（CMV）DNA载量，诊断CMV感染及指导临床抗CMV治疗的意义。方法以318例接受allo-HSCT患者为研究对象，其中同胞HLA相合HSCT患者160例，血缘关系配型不合127例，非血缘关系移植31例。移植前供受者采用ELISA方法进行CMV血清学抗体检测。移植后采用RQ-PCR方法检测血浆CMVDNA，〉6×10^2拷贝数／ml为CMVPCR阳性。全部患者在预处理阶段-9d到-2d应用更昔洛韦预防CMV感染。抢先治疗主要应用更昔洛韦或膦甲酸钠，或两药联合治疗。结果移植后100天（＋100d）内CMV感染累计发生率40．6％，同胞相合、血缘关系配型不合及非血缘关系移植三种移植方式，＋100d内CMV感染累计发生率分别为17．5％、66．1％、45．2％。无论是单因素还是多因素分析均表明，血缘关系配型不合移植和非血缘关系移植，预处理方案中使用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）以及中重度急性移植物抗宿主病是导致CMV感染发生的危险因素。在早期应用抢先治疗后，总体＋100d内CMV病累计发生率为8．8％，三种移植方式＋100d内CMV病累计发生率分别为5．6％、9．4％、22．6％。且三种移植方式CMV感染患者2年生存率差异无统计学意义。结论allo-HSCT后RQ-PCR检测血浆CMVDNA可有效用于CMV感染诊断和监测，并有利于指导临床抗CMV治疗，减少移植后CMV感染高危患者CMV疾病的发生。

康艾注射液联合化疗治疗急性白血病60例

目的观察中药制剂康艾注射液对急性白血病（AL）化疗患者不良反应的改善作用。方法将68例初治AL患者分为康艾注射液加化疗组（治疗组）34例、单用化疗组（对照组）34例；52例缓解后巩固治疗AL患者，分为康艾注射液加化疗（治疗组）26例，单用化疗（对照组）26例。结果初治AL患者Ⅲ～Ⅳ度消化道反应发生率，治疗组为55．9％（19例），对照组80．0％（27例），差异有统计学意义（P〈0．01）。初治AL患者骨髓抑制发生率，治疗组58．8％（20例），对照组88．2％（30例）差异有统计学意义（P〈0．05）；巩固治疗AL患者骨髓抑制发生率，治疗组7．7％（2例），对照组为38．4％（10例），差异有统计学意义（19〈0．01）。巩固治疗病例感染发生率治疗组42．3％，对照组73．1％，两组差异有统计学意义。结论康艾注射液联合化疗可以减轻AL患者的消化道反应、骨髓抑制反应及降低感染的发生率。