DJ-1通过保护线粒体复合体I活性介导白藜芦醇减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的:从DJ-1蛋白调节线粒体复合体I活性的角度,探讨DJ-1介导白藜芦醇(RES)预处理对抗大鼠心肌缺血再灌注(I/R)所诱发的氧化应激损伤的分子机制。方法:心肌内注射DJ-1敲减(sh-DJ-1)或阴性对照(NC)慢病毒后,通过结扎大鼠冠状动脉左前降支法构建心肌I/R模型。将SD大鼠随机分为6组:假手术(sham)组、I/R组、RES+I/R组、NC+RES+I/R组、sh-DJ-1+RES+I/R组和I_(A)CS-010759(线粒体复合体I抑制剂)+RES+I/R组,每组10只。在心肌I/R模型前7 d通过灌胃给予RES(20 mg/kg),每日一次。此外,sham和I/R组大鼠均通过灌胃接受等体积的生理盐水。TTC染色和超声心动图分别观察心肌梗死面积和心功能变化情况;MitoSOX荧光探针检测心肌中线粒体活性氧(ROS)水平;试剂盒检测血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性;结合Western blot和免疫共沉淀实验观察DJ-1与线粒体复合体I的两个亚基ND-1和NDUFA4的相互作用。结果:与I/R组相比,RES预处理可显著降低心肌梗死面积、心脏组织中线粒体ROS水平,以及血清中LDH活性和MDA含量(P<0.01),提高左室射血分数、左室短轴缩短率和血清中SOD活性(P<0.01),增加DJ-1的表达及DJ-1的线粒体转位(P<0.01),促进DJ-1与ND-1/NDUFA4的相互作用进而保护线粒体复合体I的活性(P<0.01)。然而,与RES+I/R组相比,敲减DJ-1的表达后,RES减轻心肌I/R损伤的作用被显著抑制(P<0.05或P<0.01)。结论:RES预处理可增加DJ-1的表达和线粒体易位,促进DJ-1与线粒体复合体I的ND1和NDUFA4亚基的相互作用,从而保护线粒体复合体I的活性并减轻心肌I/R所诱发的氧化应激损伤。

eNOS参与铁过载诱导的血管内皮细胞线粒体损伤

目的探讨e NOS及ADMA/DDAHⅡ介导的铁过载对HUVECs细胞线粒体的损伤作用。方法常规培养HUVECs细胞,随机分为正常对照(Ctrl)组、右旋糖酐铁(Iron)组、L-精氨酸(L-Arg)组。48 h后,MTT法检测细胞存活率;HPLC法检测ADMA含量及DDAHⅡ活性;Western blot法检测e NOS表达;比色法检测培养液LDH活性、NO含量、细胞MDA含量以及m PTP开放;流式细胞仪检测心肌细胞ROS含量、线粒体膜电位及细胞凋亡。结果 Iron处理48 h后,HUVECs细胞存活率明显降低,培养液ADMA及LDH活性升高,NO含量减少;细胞e NOS表达下调、DDAHⅡ活性降低;MDA含量与ROS生成明显增加,线粒体膜电位减小,m PTP大量开放,细胞凋亡增加;ADMA生理性对抗剂L-Arg则可明显减弱Iron的上述损伤作用。结论 e NOS参与铁过载诱导的HUVECs细胞线粒体损伤,ADMA/DDAHⅡ机制也可能发挥了作用。

Bcl-2介导的芹菜素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用

目的探讨芹菜素(apigenin,Api)在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用,并阐明Api对心肌损伤的保护作用是否主要由Bcl-2介导。方法培养H9c2心肌样细胞;随机分为正常对照(Cont)组、缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation,A/R)组、Api预处理组、Api+ABT-737组。MTT法检测细胞存活率;Western blot法检测Bcl-2表达;比色法检测培养液LDH活性、细胞SOD及GSH-Px活性、MDA含量;流式细胞仪检测心肌细胞ROS含量、线粒体膜电位及细胞凋亡。结果 Api预处理25 h后,心肌细胞Bcl-2表达呈剂量依赖性上调(P<0.01);细胞存活率升高,培养液LDH活性降低,细胞SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量与ROS生成减少,线粒体膜电位更为稳定,细胞凋亡减少(P<0.01);Bcl-2抑制剂ABT-737则可取消Api的上述心肌保护作用。结论Api抗心肌A/R损伤作用涉及Bcl-2信号通路,至少部分依赖于其对Bcl-2表达水平的上调。

川芎嗪通过14-3-3γ/Bcl-2减轻阿霉素引起的心肌毒性

目的:探讨川芎嗪(TMP)对阿霉素(Dox)心肌毒性的影响以及14-3-3γ/Bcl-2蛋白表达在其中的作用。方法:原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,随机分为Control组、Dox组、TMP+Dox组、TMP+Dox+pAD/14-3-3γ-shRNA组。48 h后,MST法检测细胞存活率,比色法检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测细胞14-3-3γ与线粒体Bcl-2表达;流式细胞法检测细胞ROS生成、线粒体膜电位及线粒体渗透压转换孔(mPTP)开放;TUNEL法检测细胞凋亡。结果:Dox处理48 h后,心肌细胞存活率显著降低,培养液LDH活性升高;细胞SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量增加,ROS生成增加;线粒体膜电位减小,mPTP持续开放,细胞Caspase-3活性与凋亡增加;TMP预处理可显著上调细胞14-3-3γ及线粒体Bcl-2表达,且同步逆转上述改变;pAD/14-3-3γ-shRNA不仅下调细胞14-3-3γ,线粒体Bcl-2表达同步减少,TMP预处理相关保护作用也随之明显减弱。结论:TMP预处理通过上调细胞14-3-3γ及线粒体Bcl-2表达,进而抑制氧化应激反应,维护线粒体功能,减少Dox心脏毒性诱导的细胞凋亡。

川芎嗪预处理对大鼠无创肢体缺血预适应心肌保护作用的影响

目的:探讨川芎嗪(TMP)预处理对大鼠无创肢体缺血预适应(R-IPC)心肌保护作用的影响。方法:取成年雄性SD大鼠40只,随机均分为5组,分别为对照(Cont)组、缺血/再灌注(I/R)组、R-IPC组、TMP组、R-IPC+TMP组。预处理时R-IPC组和R-IPC+TMP组每天R-IPC预处理1次,连续3d;TMP组和R-IPC+TMP组每天i.p.TMP 10mg/kg预处理1次,连续3d;末次预处理24h后,制备Langendorff逆灌离体心脏并作I/R损伤模型;检测冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)活性,心肌梗死面积,心肌组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、caspase-3活性,细胞凋亡情况。结果:R-IPC或TMP预处理24h后,大鼠心脏可有效对抗急性I/R损伤性的冠脉流出液中LDH、CPK活性以及梗死面积的增加,心肌组织中MDA含量上升和SOD、GSH-Px活性降低以及caspase-3活性和凋亡指数增加(P<0.01),表现出延迟保护作用;R-IPC与TMP共同预处理24h后,诱发的延迟保护作用--在LDH、CPK活性与梗死面积等指标上,二者间表现为相互协同作用稍逊于SOD、GSH-Px、caspase-3活性和凋亡指数等指标。结论:TMP预处理可有效增强R-IPC对大鼠心脏急性I/R损伤之延迟保护作用。

灯盏花素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨灯盏花素在缺氧/复氧损伤中对心肌细胞的保护作用及机制。方法:选取新生2~3d的大鼠,提取原代心肌细胞,培养后随机分为3组,每次实验设复孔,重复4次:(1)正常对照组;(2)缺氧/复氧组;(3)灯盏花素组。各实验组进行处理后,按以下指标检测:比色法检测LDH活性、GSH-Px以及SOD活性、MDA含量;MTS法检测细胞存活率;AnnexinV-FICT/PI双染法检测细胞凋亡。结果:灯盏花素预处理后,培养液中LDH活性降低,抗氧化物酶SOD和GSH-PX活性增加,脂质过氧化物MDA含量降低,细胞凋亡减少,细胞存活率得到明显升高。结论:灯盏花素可能通过抑制氧化应激反应,减轻心肌细胞A/R损伤,以起到心肌保护作用。