猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价

【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。

猴痘病毒B20R蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化的最佳咪唑洗脱浓度为40 mmol/L。以纯化的融合蛋白B20R接种免疫昆明小鼠,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫,且至免疫第42 d仍然维持较高的抗体水平,抗体效价高达1∶409600。【结论】构建的猴痘病毒B20R蛋白原核表达载体可在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式成功表达出融合蛋白B20R,且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫。

新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定

【目的】研究旨在构建新冠病毒Omicron变异株(B.1.1.529)RBD重组质粒pET-28a-RBD-dimer,利用E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用Golden Gate无缝克隆技术将密码子优化的RBD二聚体基因克隆到pET-28a载体中,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒。经表达条件优化后,以镍离子亲和层析法分离纯化RBD二聚体蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原制备鼠源抗RBD二聚体蛋白的多克隆抗体,利用间接ELISA、IFA及Western blotting试验技术分别检测多克隆抗体的效价和特异性。【结果】ELISA试验结果显示该多克隆抗体的效价高达1:256000,IFA及Western blotting试验结果表明该多克隆抗体可特异性识别原核、真核细胞表达的RBD二聚体蛋白以及商业化RBD蛋白,具有较好的特异性、反应原性和灵敏性。【结论】研究成功使用原核细胞表达Omicron RBD二聚体蛋白,其具有较好的免疫原性,可以有效制备具有较高抗体效价、特异性及灵敏度的多克隆抗体,为进一步研究原核表达的RBD二聚体蛋白的生物学功能,Omicron变异株的鉴别诊断和亚单位疫苗的开发提供依据。

猴痘病毒A23R蛋白的表达、纯化及其小鼠抗血清制备

目的 大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Western blot法鉴定。纯化后的A23R蛋白免疫小鼠,制备A23R多克隆抗体,采用ELISA检测抗体免疫滴度。结果 在0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度37℃、诱导20 h时,获得的A23R重组蛋白表达量最大,纯化后的蛋白纯度约为96.07%,经Western blot法鉴定为目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠,第6周时IgG抗体的效价达到1∶102 400。结论 成功获得高表达和高纯度的重组A23R蛋白,并制备了小鼠抗MPXV-A23R的高效价血清。

猴痘病毒E2L蛋白的表达、纯化及免疫原性评价

【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因,将其克隆至表达载体pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-28a-E2L,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)受态细胞,采用控制变量的方法对融合蛋白最佳诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。融合蛋白经His-Bind柱亲和层析纯化后,经腹腔注射免疫昆明小鼠,从免疫当天(第0 d)开始每隔7 d通过断尾法采集昆明小鼠血清1次,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】以构建的原核表达载体pET-28a-E2L转化BL21(DE3)受态细胞后,经IPTG诱导,能成功表达获得融合蛋白E2L,且主要以包涵体的形式进行表达。融合蛋白E2L的最佳诱导表达条件为40℃下以1.0 mmol/L IPTG诱导16 h,通过His-Bind柱亲和层析纯化时的最佳咪唑洗脱浓度为100 mmol/L。昆明小鼠免疫试验结果表明,纯化后的融合蛋白E2L能诱导昆明小鼠产生较高水平的体液免疫,至免疫第42 d昆明小鼠血清仍然维持较高抗体水平,抗体效价高达1∶70400,说明融合蛋白E2L具有良好的免疫原性。【结论】猴痘病毒E2L蛋白在原核表达系统能实现高效表达,且以纯化后的融合蛋白E2L免疫昆明小鼠能产生较强的体液免疫,表明具有良好的免疫原性,可用于新型猴痘病毒检测方法及预防疫苗的研发。

持续感染口蹄疫病毒VP1蛋白对细胞转录组的影响

【目的】通过转录组测序(RNA-Seq)方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15细胞分别转染pCAGGS-HA(对照载体)、pCAGGS-HA-Pi-VP1质粒,转染36 h后,Western blot检测VP1蛋白表达,同时提取两组细胞总RNA进行转录组测序(每组3个重复,2组6个样本)。将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,对差异表达基因进行了生物信息学分析。采用qRT-PCR验证关键差异表达基因的表达。【结果】RNA-Seq共鉴定出3376个差异表达基因(DEGs)|log2(Fold Change)|>0和padj<0.05,其中上调基因1744个,下调基因1632个。许多参与免疫反应和炎症的效应基因差异表达。GO和KEGG富集分析显示,差异基因GO条目绝大部分与核糖体有关,而KEGG富集中涉及了与天然免疫相关的信号通路,如TNF信号通路、Toll受体信号通路。【结论】pCAGGS-HA-Pi-VP1转染PK-15细胞之后,改变了细胞的表达谱,获得的DEGs及其功能注释信息有助于理解其对宿主细胞的影响,为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。

非洲猪瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术(LAMP),根据非洲猪瘟病毒(ASFV)ASFV p72基因保守序列设计一组LAMP引物。采用单因素试验,对影响LAMP反应的5个重要因素反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度进行优化,使用钙黄绿素-MnCl2显色液进行可视化判定,并进行灵敏度和特异性检测。结果表明,优化后的LAMP反应可检测低至103拷贝/μL的ASFV模板,且具有良好的特异性。反应体系中各成分的最佳浓度分别为甜菜碱1.25 mol/L、Mg2+8 mmol/L、dNTPs 1.25 mmol/L、Bst 3.0 DNA聚合酶320 U/mL,最佳反应温度为67℃。试验成功建立了ASFV LAMP可视化检测方法,适合猪场和农户进行ASFV的现场快速检测。

新冠病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

【目的】为了实现对新冠病毒一步法检测。【方法】采用RT-LAMP技术,利用具有反转录酶活性的Bst3.0 DNA聚合酶,以新冠病毒N蛋白基因为模板设计LAMP引物,成功建立了以新冠N蛋白基因为靶基因的RT-LAMP检测方法。同时对反应条件中的温度、镁离子浓度、NTP浓度、甜菜碱浓度以及酶浓度进行优化。通过加入钙黄绿素和氯化锰显色剂对反应结果进行判定,用ASFV p54质粒和JEV NS1质粒与稀释后模板做对照。【结果】温度为66℃,镁离子浓度为6mmol/L,甜菜碱浓度为1 mol/L,NTP为1.4 mmol/L,酶浓度为160 U/L为最优反应条件。【结论】证明了Bst3.0 DNA聚合酶对新冠N蛋白基因检测是成功的,该方法具有良好的特异性以及灵敏度。

猴痘F3L蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的猴痘病毒(MPXV)是一种能引起人畜共患病的正痘病毒属病毒,在人群和野生动物中具有较高的感染率,对人类公共卫生安全造成重大威胁。当前猴痘病毒的相关研究基础较弱,猴痘诊断试剂匮乏。本研究旨在以猴痘病毒基因F3L为对象表达F3L重组蛋白并免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体,为猴痘诊断试剂的研发奠定基础。方法克隆猴痘病毒基因F3L,构建至原核表达载体pET-28a上,测序无误后将重组质粒pET-28a-MPXV-F3L转化E.coli BL21感受态细胞,用优化的IPTG诱导表达条件表达MPXV-F3L重组蛋白,表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体滴度。结果克隆得到的猴痘病毒F3L基因片段长度为471 bp,表达的pET-28a-MPXV-F3L重组蛋白分子质量约为24.6 ku,其最佳表达条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、温度42℃、时间12 h。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达95.29%,经Western blot鉴定表达蛋白能被相应抗体识别。用该蛋白免疫小鼠,制备获得F3L多克隆抗体ELISA滴度为4.709。结论重组表达的F3L蛋白具有抗原性,免疫小鼠后能刺激产生高滴度的血清抗体,为F3L蛋白功能分析、猴痘病毒的致病机制研究以及诊断试剂和疫苗的开发奠定了基础。