关于提高医学生物化学实验教学质量的思考

医学生物化学是医学生非常重要的一门基础课，也是实践性较强的科学。培养综合型人才，除了必须具备扎实的理论外，还应该有过硬的操作技能和开拓创新的研究思维，而良好的实验教学为培养医学大学生的动手能力及研究思维提供坚实的平台。实验教学是生物化学教学的重要组成部分，可以使学生牢固掌握生物化学研究的基本方法与实验技术，加深对基本理论知识的理解，提高对未知生命现象的兴趣，培养学生严谨求实、勤奋进取的科学态度。本人通过在教学实践中的研究和探索，就如何提高生物化学实验教学质量提出几点想法。

医学生物化学留学生实验课教学的新思路探索

该文针对留学生医学生物化学的培养目标,从留学生实验教学的内容、方法及考核形式等多各方面探讨了留学生实验教学改革的新思路,以满足现代留学生医学教育的新需求。生物化学实验教学注重理论与实践相结合,在实验教学过程中更应使用启发和演示教学手段为主,在理解实验内容和原理的基础上结合医学生物化学本身的特点,提高留学生实践和科研能力,培养合格的医学人才。

生物化学实验教学多元化考核体系改革探讨

生物化学是高等医学院校的一门重要的基础学科,生物化学实验是生物化学的一个重要内容。重视生物化学实验教学改革,培养学生严谨的科学作风、独立工作的能力及科学的思维能力,对于提高学生的科学素质具有重要的意义。文章对传统生物化学实验教学中考核方法进行了探索和创新,针对生物化学实验的考核方式、考核内容、考核标准进行改革,力求更全面、客观地评价学生的实验学习成绩。强调学生注重基本操作和实验过程、强化能力培养,为更好地培养基础理论扎实、具有创新精神和实践能力的高素质应用型人才提供有力保障。

生物化学本科教学与科学研究人才的培养

生物化学是应用化学的理论和方法来研究生命现象,在分子水平上阐明生命现象的化学本质,它在分子水平探讨生命的本质,是生命科学领域的重要基础学科和前沿学科[1]。上世纪末到本世纪初,生物化学呈现出突飞猛进的发展势头,生物化学的发展带动着环境科学、医药学、生物工程技术等相关学科的发展,使其也到达了高水平、全新的发展阶段。

理论联系实际—多种教学手段在生物化学教学中的综合应用

众多的生物化学的教学方法各有优势,将这些教学方法和手段充分利用起来,将更好的提高生物化学教学质量。在传统教学模式的基础上,利用PBL方法引入案例,可尽量利用网络或社会热点问题作为案例来提高学生兴趣,以多媒体(视频等)互联网等方式表现案例,以有目标的提问为主线,让学生在案例教学中掌握重点、理解过程,开拓思路,提高素质,使生物化学教学在其乐融融的氛围中,达到最良好的效果。

开设医学本科生PCR实验的教学体会

结合分子生物学中PCR实验的开设,从实验前的各项准备工作到学生实验的教学过程及实验课后的思考等方面进行分析和总结,得到一些实践体会,以期为今后的实验教学改革提供参考。

姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞iNOS表达的抑制及抗氧化作用

用姜黄素预处理小胶质细胞株BV,1h后加用脂多糖(200ng/ml)进行刺激,通过MTT检测细胞活性;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western印迹、免疫细胞化学染色检测细胞活化后形态及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达;瞬时转染和荧光素酶报告基因鉴定iNOS和NF-κB基因表达活性;SOD和GSH-Px检测姜黄素的抗氧化能力.结果证明,脂多糖可促使小胶质细胞活化,使iNOS和NF-κB基因表达活性显著增强;iNOS蛋白表达明显上调,NO释放增多;细胞内SOD和GSH-Px活性明显下降.而姜黄素(10μmol/L)可以显著抑制活化后小胶质细胞NO的产生、iNOS蛋白的表达及iNOS-Luc、NF-κB-Luc的表达活性,其机制可能通过NF-κB的信号转导途径抑制iNOS的表达.姜黄素可通过提高细胞内SOD和GSH-Px的活性发挥抗氧化作用.

O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达的抑制对tau蛋白磷酸化作用的影响

研究HEK293T细胞中O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达抑制对与AD密切相关的tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响.以OGT基因为靶点设计三段siRNA(OGT-siRNA1～3),用脂质体的方法转染OGT-siRNA1～3进入HEK293T细胞,通过RT-PCR检测OGT-siRNA1～3对OGT mRNA的抑制.将pEGFP/OGT与OGT-siRNA1～3共转染HEK293T细胞,24h后在倒置荧光显微镜下观察各组GFP/OGT的表达,根据GFP/OGT的表达量来评价OGT-siRNA1～3对OGT基因表达的抑制率.将筛选出的具有最佳沉默效果的OGT-siRNA与质粒pCI/tau441共转染HEK293T细胞,48h后Western blot检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化.OGT-siRNA3在100nmol/L的终浓度时对OGT基因的抑制效率最高.与Mock组相比,对OGT基因mRNA及蛋白质水平的抑制率分别可达80.0%与51.3%左右.OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降,而磷酸化水平增高,证实tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在AD的发生发展中起关键作用.

蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响

蛋白质的O位N 乙酰葡萄糖胺 (O GlcNAc)糖基化修饰是一种新近发现的广泛存在于细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰 .其性质与经典的膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰不同 ,而与蛋白质磷酸化修饰更相似 .O GlcNAc糖基化和磷酸化均修饰tau蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基 ,通过改变O GlcNAc糖基化供体底物浓度以及其关键酶活性等方法 ,改变分化后成神经细胞样的PC12细胞中的蛋白质O GlcNAc糖基化修饰水平 ,然后用特异性识别不同位点磷酸化的tau蛋白抗体 ,进行蛋白质印迹分析来检测tau蛋白磷酸化水平的变化 .结果发现细胞内蛋白质O GlcNAc糖基化对tau蛋白磷酸化的影响 ,在不同的磷酸化位点其影响不同 .增加蛋白质O GlcNAc糖基化修饰导致tau蛋白大多数磷酸位点的磷酸化水平降低 ,反之亦然 .这些结果说明 ,tau磷酸化在大多数位点受到O GlcNAc糖基化修饰的负性调节 .

NOV蛋白在切割海马伞大鼠海马中表达的变化

通过切割右侧海马伞制备大鼠海马伞损伤模型,应用Westernblotting、免疫组织化学技术,观察切割海马伞后不同时程海马中肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)蛋白表达的变化,并对结果进行图像处理和统计学分析。Westernblotting结果显示,NOV蛋白在切割海马伞后3d表达开始上升,14d达高峰后缓慢下降。切割海马伞后14d切割侧和正常侧相比较,海马CA1-CA3区的锥体细胞层及齿状回颗粒层NOV阳性细胞数目无显著性差异(P>0.05),但切割侧NOV阳性细胞明显比正常侧深染,两侧比较平均灰度值有显著性差异(P<0.01)。结合本课题组以往的工作,本研究结果提示,切割海马伞后海马中高表达的NOV蛋白可能参与了诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的过程。

姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用

目的：观察姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞NO的产生及iNOS表达的影响。方法：用脂多糖（200ng／m1）刺激小胶质细胞株BV的同时用不同浓度姜黄素进行干预，应用MTT方法检测细胞活性；硝酸还原酶法检测细胞上清液中NO的含量；Western—blot及免疫细胞化学染色方法检测iNOS蛋白的表达。结果：姜黄素在2．5～20μmol／L范围内对细胞活性无影响；脂多糖作用24h后，NO释放量明显增加，iNOS蛋白表达明显增强；使用姜黄素干预后，浓度在10μmol／L时可以显著抑制脂多糖激活的小胶质细胞NO的产生和iNOS蛋白的表达。结论：姜黄素能够有效抑制脂多糖激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生。

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

切割海马伞海马中56kD差异蛋白的质谱分析

目的:探讨切割海马伞海马中具有生物活性的56kD差异蛋白的组成成份及其功能。方法:切割SD大鼠海马伞后14d海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE),应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对56kD差异蛋白进行检测和功能分析。结果:质谱分析找到了33组肽段,这些蛋白按照其功能可以分为:细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、核酸水解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结论:切割海马伞海马中56kD差异蛋白中含有功能涉及神经干细胞迁移、分化的蛋白质。

海马放射状胶质细胞激活后Rest和Runx1t1基因的表达变化

目的探讨经切割穹隆海马伞侧海马提取液诱导而激活的海马放射状胶质细胞的基因表达变化。方法将分离、纯化后的海马放射状胶质细胞分别加入正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液,7d后利用免疫荧光法检测两组细胞的数量和生长情况;利用基因芯片分析细胞内基因表达情况;利用实时定量PCR分析神经干细胞向神经元分化的相关基因Rest和Runx1t1的转录情况。结果与正常组相比,切割组放射状胶质细胞的数量明显增多,胞体增大,突起增粗变长。基因芯片结果显示,在所检测的709个基因中,切割组中10个基因表达明显上调,10个基因明显下调;实时定量PCR结果表明,切割组Rest和Runx1t1的转录水平均显著高于正常组(P<0.05)。结论切割穹隆海马伞海马提取液可诱导海马放射状胶质细胞的激活,提高Rest和Runx1t1基因转录水平。

PD模型大鼠黑质中Nurr1和TH的表达变化及其意义

为探讨孤儿核受体(Nurr1)在多巴胺能神经元损伤修复过程中对特异性表型酪氨酸羟化酶(TH)的影响,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠一侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病(PD)模型,分别应用Western blot和免疫组织化学技术观察不同时间点中脑黑质中Nurr1、TH蛋白表达的变化及其相关性。结果显示,Nurr1蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中即明显下降,7d后开始逐渐上升,14d接近正常水平,28d明显升高;TH蛋白表达在术后1d损伤侧黑质中无明显变化,7d开始下降,14d达最低,28d开始上升。上述结果提示,在6-OHDA损伤黑质-纹状体通路后,Nurr1的表达先下降后上升,其表达变化早于TH,可能在PD模型大鼠的损伤修复中发挥重要作用。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

反义寡核苷酸阻断乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合成酶的表达和意义

目的探讨靶向葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)的基因试剂MBO-asGCS逆转乳腺癌多药耐药的作用机制及其意义。方法MBO-asGCS处理体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药型MCF-7/AdrR,采用细胞毒性分析测定MBO-asGCS对MCF-7-AdrR存活率的影响,RT-PCR和Western印迹分析对耐药型细胞GCS的表达变化,检测对caspase 3/7的活性影响及流式细胞仪测定MBO-asGCS对耐药型细胞的凋亡情况。结果MBO-asGCS转染人耐药型乳腺癌细胞MCF-7/AdrR后,与未转染组细胞的IC50分别是0.18μmol/L和12.50μmol/L,药物敏感性提高了69倍;MBO-asGCS抑制GCS的mRNA表达70%,减少GCS蛋白表达39%(P<0.01);转染MBO-asGCS后耐药型细胞的caspase 3/7活性上升53%(P<0.05),细胞凋亡率上升5.6倍(P<0.01)。结论GCS过表达是耐药型乳腺癌细胞的特征,靶向人GCS的反义寡核苷酸可直接抑制GCS的过表达,诱导耐药细胞凋亡,有效逆转其耐药性,GCS可能是治疗耐药型乳腺癌的一个潜在靶点。

新型寡核苷酸对乳腺癌细胞葡萄糖神经酰胺合酶与P-糖蛋白表达的影响

目的:观察新型反义寡核苷酸MBO-asGCS对乳腺癌细胞中葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)与P-糖蛋白(P-gp)表达的影响。方法:实时PCR检测MBO-asGCS处理的耐药型乳腺癌细胞MCF-7-AdrR,蛋白质印迹分析MCF-7-AdrR及其转化细胞中GCS与P-gp的蛋白表达,TUNEL法检测MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中的细胞凋亡情况。结果:在耐药株和GCS过表达的MCF-7-AdrR/GCS中GCS和P-糖蛋白表达特征性上升,而在asGCS转化细胞MCF-7-AdrR/asGCS中GCS和P-糖蛋白表达明显下降;MBO-asGCS处理的MCF-7-AdrR中GCS基因表达下调63.6%,凋亡细胞显著增加(P<0.01)。结论:乳腺癌细胞的耐药机制中可能存在GCS和P-糖蛋白的某种关联,升高的GCS可促进神经酰胺的代谢并增强P-糖蛋白的表达,产生耐药现象,反义寡核苷酸可抑制GCS表达,下调P-糖蛋白并促进凋亡。

番茄NAC家族基因的鉴定及其功能预测

利用生物信息学方法对番茄NAC转录因子家族成员、序列、保守区、分子量、等电点等基本信息进行分析,结果显示,番茄NAC家族包含101个蛋白质,分为12亚族(I^XII)。功能预测显示,20个NAC基因可能与植物抗逆相关,8个NAC基因可能与植物所参与的渗透胁迫和衰老有关,24个NAC基因可能与发育相关。该研究为番茄NAC转录因子家族基因功能分析提供信息基础,从而对番茄品种的改良提供候选基因。

去甲斑蝥素抗癌作用的分子机理研究

去甲斑蝥素对钙调素激活的环核苷酸磷酸二酯酶具有抑制作用，IC50为2．8mmol/L,在大于1．0mmol/L时，对钙调素依赖性环核苷酸磷酸二酯酶的基础活性也表现抑制能力。这可能是去甲斑蝥素作为抗癌药的分子药理学基础。