一氧化氮合酶神经元在大鼠中脑导水管周围灰质和中缝核簇内的定位研究

研究用一氧化氮合酶组织化学方法对大鼠中脑导水管周围灰质和中缝核簇一氧化氮合酶阳性神经元的精确定位分布进行了系统的观察。一氧化氮合酶阳性神经元胞体和纤维主要密集分布于中脑导水管周围灰质吻段的背外侧核以及中段和尾段的腹外侧核 ,中缝背核以及线形核内也观察到大量的一氧化氮合酶阳性胞体和纤维 ,在中缝正中核和中缝隐核内可见中等量的一氧化氮合酶阳性神经元胞体和纤维 。

神经细胞培养法观察单味中药促神经生长的研究

寻找有效的促神经生长的中药成份是当代中医药学和神经科学中日趋受重视的课题。为了阐明具有确切作用的促神经生长的单味中药，该研究采用神经细胞培养方法，从百余种中药中筛选出了牛膝、当归、菟丝子、白术等具有明显促神经生长作用的单味中药。该结果从细胞水平为中药促神经生长提供了科学依据。

脑源性神经营养因子研究现状

本文主要综述了脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）的发现、生化特性、与神经生长因子（ＮＧＦ）和神经营养因子Ⅱ（ＮＴ－３）属于同一基因家族以及靶源性等概念：总结了脑源性神经营养因子对运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺神经元及感觉等其它神经元的效应作用，并展望了应用脑源性神经营养因子治疗运动神经元病变及老年神经系统退行性疾病的前景。

神经干细胞研究进展

成年哺乳动物包括人类的中枢神经系统的广泛区域都存在有神经干细胞 ,其中能终生产生神经元且增殖活跃的区域为前脑室下带和海马齿状回的亚颗粒带。从这些区域分离出的神经干细胞 ,经表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)或碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的刺激可增殖。在一定条件下可使增殖的神经干细胞向所需的神经元如多巴胺神经元、胆碱能神经元等分化 。

一氧化氮合酶和5-羟色胺在体外培养的胚鼠脑干神经元内的共存研究

采用 NADPH-d组织化学和 5 -羟色胺免疫组织化学双重反应技术 ,探讨在体外培养条件下 E14 d SD胚鼠脑干神经元中5 -羟色胺与一氧化氮合酶阳性神经元的体外生长发育过程以及 5 -羟色胺与一氧化氮合酶的共存。将 E14 d SD胚鼠脑干细胞悬液接种于 2 4孔培养板 ,实验按培养龄分 4组分别在接种后 5 d、10 d、15 d和 2 1d终止培养 ,先进行 NADPH-d组织化学反应 ,再行 5 -羟色胺免疫组织化学反应。结果显示 :各实验组均可观察到三种神经元 ,即 5 -羟色胺免疫阳性神经元、一氧化氮合酶阳性神经元和两者的双重阳性神经元 ,其中双重阳性神经元占多数 ,并以梭形神经元为主 ,胞体呈三角形、多角形、梭形或卵圆形。 10 d组的双重阳性神经元突起最长可达 60 0μm以上 ,末端可见明显的生长锥 ,轴突终末分支上分布有大量的膨体 ,并与其它神经元的胞体或突起之间形成接触。本研究结果证明一氧化氮合酶和 5 -羟色胺可以在体外培养的胚鼠脑干神经元内共存 ,提示一氧化氮合酶可能与 5 -羟色胺共同参与胚脑的发育。

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的影响。 方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,14d后取两侧海马制成提取液 ;将神经干细胞接种于 3块 2 4孔培养板中 ,每板分成切割组、正常组和对照组各 8孔 ,前 2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第 1、2块分别于第 7d和14d时行MAP 2免疫荧光检测 ;第 3块于 10d时行AChE组织化学染色。计数MAP 2和AChE阳性神经元数 ,观察胞体大小和突起长度。 结果 切割组第 7d时MAP 2阳性神经元较多 ,胞体大、突起长 ,14d时细胞进一步迁移、成熟 ;正常组第 7d时仅见少量突起短的MAP 2阳性神经元 ,14d时细胞稍增多 ,突起稍增长 :对照组第 7d时未见MAP 2阳性神经元 ,14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP 2阳性神经元。第 10d切割组AChE阳性神经元较多 ,突起多而长 ,正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元 ,对照组未见AChE阳性神经元。 结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。

银杏内酯B对成年大鼠神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨银杏内酯B对神经干细胞分化为神经元的促进作用。 方法 采用无血清培养和单克隆实验技术在体外分离培养出大量来源于同一细胞的单细胞克隆球 ,并将其均匀种植于 2 4孔培养板中 ,分 3组分别加入含银杏内酯B、BDNF和不加任何细胞因子的完全培养液。培养 7d和 14d后终止 ,用神经元特异性标记物微管相关蛋白 2 (MAP 2 )的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,荧光显微镜下观察和计数MAP 2标记的阳性细胞并对细胞面积和周长进行图像处理。 结果 两个时期银杏内酯组MAP 2阳性细胞数均明显多于单纯对照组而少于BDNF组 ;分化 7d和 14d时银杏内酯组MAP 2阳性细胞的面积和周长明显大于单纯对照组 ,而略小于BDNF组。结论 银杏内酯B亦具有类似BDNF促进神经干细胞分化为神经元的作用。

穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响

为观察成鼠神经干细胞移植入切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马后存活和分化为神经元的状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带神经干细胞 ,进行 Brd U标记和扩增。切割 SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,术后 2周将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回。 2月后 ,行 Nissl染色、Brd U免疫荧光、NF -2 0 0 / Brd U免疫荧光、β-tubulin- / Brd U免疫组织化学染色和 ACh E组织化学染色。结果发现 ,移植的神经干细胞在海马齿状回中存活并沿颗粒下层迁移 ,切割侧海马齿状回中有较多的 Nissl深染的大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞。切割侧海马齿状回颗粒下层中见有数个NF-2 0 0 / Brd U、β-tubulin- / Brd U双标神经元和 ACh E阳性神经元 ,而正常侧海马中则未能见到。上述结果提示 ,移植到海马中的神经干细胞能存活、迁移 ,穹窿海马伞切割侧海马中某些物质的表达增强 ,可诱导植入其内的神经干细胞向神经元或 ACh E阳性神经元分化。

大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移

为观察成鼠神经干细胞移植入切割海马伞侧海马和正常侧海马后的存活和迁移状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带组织的神经干细胞 ,并用 Brd U标记、扩增。在切割 SD大鼠右侧海马伞术后 14 d,将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回中。分别于术后 1周、2周、1个月和 2个月时取脑、冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 Brd U免疫荧光检测。结果发现 ,1周和 2周时移植细胞主要围绕在移植点周围 ;1个月和 2个月时 ,移植细胞沿着海马齿状回颗粒下层迁移排列成条带。在所有的脑组织切片中 ,切割海马伞侧海马内移植细胞的密度均明显地大于正常侧海马内的移植细胞密度 ,且切割海马伞侧海马内 Nissl深染的大胞体神经元样细胞明显地多于正常侧。提示 ,移植至海马齿状回中的神经干细胞可存活并可沿海马齿状回颗粒下层迁移 ;切割海马伞侧海马中存活和迁移的神经干细胞密度大于正常侧者 。

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 。

BDNF、NGF对体外长期培养的胚基底前脑胆碱能神经元的影响

本文探讨了脑源性神经营养因子、神经生长因子对体外长期培养的胚基底前脑胆碱能神经元是否具有延缓退变的作用。实验分为脑源性神经营养因子组、神经生长因子组、脑源性神经营养因子加神经生长因子组及单纯对照组。取孕 17d SD大鼠胚基底前脑原基制成细胞悬液接种于 2 4孔培养板中 ,按分组加入含相应神经营养因子和不含神经营养因子的 DMEM培养液 ,分别于体外培养 12、18、2 4、3 0 d后进行乙酰胆碱酯酶组织化学反应。显微镜下计数各孔中乙酰胆碱酯酶阳性神经元数 ,每孔随机测量和计数 2 5个乙酰胆碱酯酶阳性神经元的平均胞体直径、发出的突起数和最长突起长度。数据用方差分析和 SNK检验进行统计学处理。结果显示 ,在培养的 4个时期 ,含脑源性神经营养因子组、神经生长因子组和脑源性神经营养因子加神经生长因子组的各项数据均明显地优于单纯对照组 ;脑源性神经营养因子加神经生长因子组的各项数据 ,特别是最长突起长度优于单独使用脑源性营养因子或神经生长因子组。提示 :脑源性神经营养因子和神经生长因子不仅对体外培养的胚胆碱能神经元发育生长具有促进作用 ,而且还可延缓体外长期培养的大鼠胚基底前脑胆碱能神经元的退变 ;

提高成年大鼠神经干细胞单克隆形成率的方法

目的 探索提高神经干细胞单克隆形成率的方法并证实所分离培养的神经干细胞仍具有多分化潜能。 方法 对神经干细胞单克隆方法进行改良 ,即在单克隆培养液中加入 1 2原代克隆培养液。将所得到的单细胞克隆球消化、分离、增殖成大量的神经干细胞球 ,用含血清的DMEM分化培养液促其分化。 14d后 ,分别用神经元和胶质细胞的特异性标记物MAP 2标记神经元、GFAP标记星形胶质细胞和CNP标记少突胶质细胞。 结果平均每块含 1 2原代克隆培养液的 96孔培养板中有 2～ 3只孔可形成克隆球 ,而含纯新鲜培养液的培养板中仅 0 5～ 1 0只孔可形成克隆球。这些单细胞克隆球增殖后得到的大量亚细胞系克隆球分化后分别呈MAP 2、GFAP和CNP免疫荧光阳性。 结论 单细胞克隆实验中加入 1 2原代克隆培养液可提高神经干细胞的单克隆形成率 ,单克隆球增殖后得到的大量亚细胞系克隆球亦具有多分化潜能。

BDNF、NGF对AD模型鼠脑移植区胚胆碱能神经元发育生长的调控

目的探讨脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）、神经生长因子（ＮＧＦ）对ＡＤ模型鼠脑植入胚基底前脑后行为改善和移植区胚胆碱能神经元发育生长的影响。方法用使君子酸损毁ＳＤ大鼠基底大细胞核制成ＡＤ模型，分成ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ及单纯移植对照４组。在额、顶叶皮质植入同种胚基底前脑细胞悬液，前３组含相应神经营养因子，移植后每２ｄ向侧脑室灌注相应神经营养因子共７次。移植后１、２．５和４个月时行避暗回避试验和跳台试验，最后脑切片经ＡＣｈＥ组织化学、ＣｈＡＴ和ＬＮＧＦＲ免疫组织化学等染色，对移植区中的神经元及纤维作定量分析和图像处理。结果移植后应用神经营养因子的动物较对照组行为改善明显迅速，ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ组行为改善又较ＢＤＮＦ组或ＮＧＦ组明显。形态学证实，应用神经营养因子动物移植区中ＡＣｈＥ阳性神经元数、１６９００μｍ２网格中ＡＣｈＥ阳性纤维交点数及ＡＣｈＥ阳性神经元面积均优于对照组，ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ组的结果又好于ＢＤＮＦ组或ＮＧＦ组。结论ＢＤＮＦ与ＮＧＦ一样能促进植入胚基底前脑的ＡＤ模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长，ＢＤＮＦ和ＮＧＦ联合使用比单独使用一种因子更为有效。

EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

本研究旨在探索可促进成年大鼠神经干细胞增殖并形成较多的克隆球以及其分化出较多神经元的因素。取成鼠前脑室下区的组织进行原代培养 ,将之分为三组分别加入 EGF、b FGF以及 EGF+ b FGF,观察克隆球的形成状况。一周后收集三组原代细胞克隆球 ,加入完全培养液 (仅含 10 %胎牛血清 )进行分化实验。分化 14 d后 ,分别用 MAP-2和 GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,计算阳性细胞数量。无血清培养结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组原代培养液中形成的原代克隆球数量和直径的差别不明显 ,但都明显地大于 EGF组。免疫荧光结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组中的克隆球分化出 MAP-2阳性神经元的数量明显多于 EGF组 ,而 EGF组则能产生较多的胶质细胞。提示 ,b F GF能促进成年大鼠神经干细胞增殖 ,所形成的细胞克隆球能分化为较多的神经元。

大鼠下丘脑室旁核中一氧化氮合酶阳性神经元的生后发育

本文用NADPH－d组织化学方法观察NOS阳性神经元在大鼠下丘脑室旁核生后发育各阶段（1、7、14、21、28和90d）的形态及分布特征。结果显示，1d时下丘脑室旁核内已有密集的NOS阳性神经元分布，但随生长发育，室旁核的截面积逐渐变大，其中的NOS神经元主要集中在该核的外侧大细胞部以及腹侧部，单位面积中的NOS神经元的密度逐渐降低。到21d，下丘脑室旁核NOS阳性神经元的分布密度较1d时下降50％。28d以后至成年鼠（90d），此密度维持在一定水平．提示下丘脑室旁核中NOS神经元的生后发育主要在生后1d至21d之间，并提示胚胎时期该核中已有NOS神经元存在。

BDNF、NGF对体外培养的胚胆碱能神经元生长发育的影响

本文用AChE组化方法，研究了BDNF、NGF对培养的胚鼠基底前脑胆碱能神经元的作用及BDNF和NGF的协同作用。结果表明BDNF和NGF都具有增加AChE阳性神经元数量的作用，二者的不同在于BDNF作用出现的时间较早、强度较小；而NGF作用出现的时间较迟但强度较大。并发现BDNF对体外培养的胚胆碱能神经元胞体早期的生长发育作用比较明显，而NGF的作用则不甚显著。BDNF对胚胆碱能神经元发出突起和突起的延伸作用较NGF强。BDNF和NGF的联合作用较单独使用BDNF或NGF为好。本文的结果提示在体外培养中两种营养因子联合应用较只用一种因子有益。

大鼠内侧隔核、斜角带中NOS与ChAT、NGF-R、AChE的共存神经元

用酶组织化学和免疫组织化学双标技术，观察了正常ＳＤ大鼠基底前脑内侧隔核（ＭＳ）、斜角带垂直支（ＶＤＢ）和水平支（ＨＤＢ）中ＮＯＳ阳性神经元的形态和分布及ＮＯＳ与胆碱能神经元标志物ＣｈＡＴ、ＮＧＦ受体（ＮＧＦ－Ｒ）和ＡＣｈＥ之间的共存关系。结果发现，ＭＳ、ＶＤＢ和ＨＤＢ的头端ＮＯＳ阳性神经元较多、胞体较大、突起多，尾端ＮＯＳ阳性神经元数目较少、胞体较小、突起少而短。ＮＯＳ＋ＣｈＡＴ双标神经元占ＮＯＳ阳性神经元总数的９０％，占ＣｈＡＴ阳性神经元总数的３９％；ＮＯＳ＋ＮＧＦ－Ｒ双标神经元占ＮＯＳ阳性神经元总数的８３％，占ＮＧＦ－Ｒ阳性神经元总数的４０％；ＮＯＳ＋ＡＣｈＥ双标神经元占ＮＯＳ阳性神经元总数的９６％，占ＡＣｈＥ阳性神经元总数的３９％。这些结果为研究Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ病理过程中基底前脑隔区胆碱能神经元退变与ＮＯ的关系提供了形态学依据。

银杏内酯对胚基底前脑NOS、AChE阳性神经元发育的影响

目的 探讨银杏内酯对胚基底前脑NOS和AChE阳性神经元发育的影响。方法 实验分成银杏组、NGF组、BDNF组和单纯对照组 ,取孕 17dSD大鼠胚基底前脑原基制成细胞悬液接种于 96孔培养板和 2块 2 4孔培养板中 ,分别加入含银杏内酯、NGF、BDNF及不含上述成份的DMEM培养液 ,于体外培养 18d后 ,96孔培养板行MTT比色分析测定光吸收值 (OD值 ) ,以检测培养的神经元活力。2块 2 4孔培养板分别行NADPH d和AChE组化染色 ,显微镜下计数各组每孔中的NOS和AChE阳性神经元数 ,并用CMM 30 1图像分析系统对两种神经元的细胞面积和细胞周长进行处理 ,数据用方差分析和SNK检验进行统计学处理。结果 银杏组MTT比色分析的OD值和NOS、AChE阳性神经元数、细胞面积、细胞周长等指标均明显地好于单纯对照组 ,达到或仅稍差于NGF组或BDNF组的指标。

中枢神经系损伤后不同时期星形胶质细胞的变化

将神经毒６－羟多巴胺（６－ＯＨＤＡ）注入大鼠一侧中脑腹侧被盖区，用胶质原纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体对损伤鼠中脑切片进行免疫组织化学ＡＢＣ法检测，观察星形胶质细胞在受损伤１ｄ至３０ｄ的不同时期的变化。术后１～３ｄ，针道所经处见有ＧＦＡＰ阳性反应的细胞和纤维，其胞体增大，纤维短粗。术后１周，针道周围反应性胶质细胞增多，有些反应性胶质细胞发出长的突起横向延伸垂直于针道，损害区附近血管增生，紧贴血管外周的胶质细胞也出现反应性变化。术后１０～１４ｄ，损害区反应性胶质细胞进一步增多，与针道方向垂直排列的胶质细胞突起更多、更长，受损侧中脑脚底的胶质细胞胞体较对侧增大，突起也增粗。术后３０ｄ与１４ｄ时的变化类似，但垂直于针道的横向纤维已不如１４ｄ时明显。用等量生理盐水代替神经毒注射后，针道周围的胶质变化除胶质反应略轻外与神经毒组基本相似。本研究表明，中枢神经系受损伤时星形胶质细胞的反应性变化在１０～１４ｄ达到高峰，以后渐趋稳定。

单唾液酸神经节苷脂对MPTP损害中脑多巴胺神经元的保护作用

本文研究单唾液酸神经节苷脂（ＧＭ１）对大鼠中脑多巴胺（ＤＡ）神经元体外生存及其损伤后的保护作用。取胚胎腹侧中脑制成细胞悬液，常规体外培养。实验分为四组：第一组在培养液中加入ＧＭ１（ＧＭ１组）；第二组在培养过程中使用１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）破坏ＤＡ神经元（ＭＰＴＰ组）；第三组在使用ＭＰＴＰ破坏ＤＡ神经元的同时给予ＧＭ１（ＧＭ１－ＭＰＴＰ组）；第四组为正常对照组。四组培养细胞定期抽出作免疫组化和荧光组化染色。ＧＭ１组培养各阶段，酪氨酸羟化酶（ＴＨ）免疫反应阳性细胞数量均明显多于对照组，至体外培养２周时，每孔阳性细胞数平均可达７２．８个，与对照组相比有显著性差异。ＭＰＴＰ组在加入ＭＰＴＰ１周左右，荧光组化阳性细胞已基本消失，此后ＴＨ免疫反应阳性细胞逐渐减少，至体外培养２周，每孔ＴＨ阳性细胞数平均仅剩１４．５个，与对照组相比有显著性差异。在残存的ＤＡ神经元中，突起变短或消失。ＧＭ１－ＭＰＴＰ组，体外培养期间均可看到荧光组化阳性细胞，ＴＨ免疫反应阳性细胞数量在体外培养２周时平均每孔为３１．７个，明显高于ＭＰＴＰ组。研究结果表明ＧＭ１能提高体外生长的ＤＡ神经元的生存率，并能减轻ＭＰＴＰ对?