壳聚糖作载体的神经干细胞移植修复脑损伤研究

目的:探讨壳聚糖作载体的NSCs移植及NGF的应用对大鼠TBI的修复作用。方法:用低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs进行扩增,并标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型,随机分为3组:损伤对照组清创后不做移植;NSCs+支架移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植;NSCS+支架+NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植,并在其中加入NGF。术后3个月在损伤区或移植区注射BDA追踪剂,行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标及BDA组化染色。结果:两移植组的认知功能较损伤对照组明显改善,含NGF的移植组改善更加显著。Nissl染色见损伤对照组创伤区形成烧杯状空洞、海马萎缩变形。而两移植组创伤区有移植物填充并与宿主整合,创伤侧海马萎缩变形不明显;两移植组在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞,含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长;BDA组化染色显示两移植组移植区内的细胞突起已延伸至宿主脑组织,含NGF的移植组向宿主脑组织延伸的突起较多。结论:大鼠TBI后行壳聚糖作载体的NSCs移植,可以改善大鼠的认知功能,NSCs可以向神经元分化并与宿主脑组织建立联系,NGF对其具有促进作用。

切割海马伞大鼠海马中65kD和83kD差异蛋白诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用

目的：探讨切割海马伞大鼠海马中65 kD、83 kD差异蛋白是否具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。方法：切割海马伞后的海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将65 kD、83 kD差异蛋白胶条与大鼠神经干细胞球共培养,计数神经球朝胶条方向1/4扇区内迁移出的细胞数。10 d后行微管相关蛋白2(MAP-2)免疫荧光,计数其中MAP-2阳性神经元数,图像处理其胞体面积和细胞周长。结果：83 kD切割组朝胶条方向迁移的细胞最多,迁移速度最快。其分化的神经元数量多,胞体大、周长长,明显地优于83 kD正常组、65 kD切割组、65 kD正常组和空白对照组。结论：大鼠海马组织中83 kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。

切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物联合诱导海马NSCs向胆碱能神经元的分化

为探讨切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物(extract of ginkgo bilobo,EGb)在海马NSCs向胆碱能神经元定向分化中的作用,分别制备大鼠穹窿海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离扩增的NSCs球分成4组,应用不同的培养液促其分化:(1)联合组:含切割侧海马提取液和银杏内酯的DMEM/F12培养基;(2)提取液组:含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(3)EGb组:含银杏内酯的DMEM/F12培养基;(4)对照组:含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基。培养14d后行ChAT免疫荧光检测,计算ChAT阳性神经元的分化率,图像处理细胞面积和周长。结果显示联合组各项指标均明显优于其它各组(P<0.01);提取液组、EGb组各项指标也均优于对照组(P<0.05);细胞面积提取液组优于EGb组(P<0.05),细胞周长EGb组优于提取液组(P<0.05),两组ChAT阳性神经元分化率无明显差异(P>0.05)。上述提示切割穹窿海马伞的海马提取液和EGb联合应用可诱导海马NSCs分化为更多、更为成熟的胆碱能神经元。

移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化

目的:探讨移植的NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活、分化情况及其对TBI大鼠认知功能的影响。方法:低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs扩增、标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型,随机分为3组:损伤对照组清创后不做移植;NSCs+支架移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植;NSCs+支架+NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植,并在其中加入NGF。术后1、2、3个月行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标染色。结果:两移植组的认知功能在术后1、2、3个月较损伤对照组明显改善,含NGF的移植组改善更加显著。两移植组术后1、2、3个月在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞,含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长。结论:大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在脑损伤区壳聚糖载体中长期存活并向神经元分化,可以改善大鼠的认知功能;NGF对其具有促进作用。

海马放射状胶质细胞的体外诱导激活及其意义

为探讨海马放射状胶质细胞在切割穹窿海马伞侧海马提取液的诱导下形态发生的变化,将培养的海马胶质细胞接种于24孔培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液,分别于培养后1、3、7和14d时行BLBP免疫荧光检测和Hoechst标记。计算两组各天时BLBP阳性细胞占Ho-echst阳性细胞的百分比,并用LeicaQiwn图像处理软件检测BLBP阳性细胞的周长和面积(含突起)。Stata8.0统计软件行组间比较。结果显示,1d时诱导组BLBP阳性细胞的比例稍高于对照组,两组细胞胞体均较小,突起均较短较细,无明显差异;3d时,诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组,且胞体较大,突起较粗较长;7d时诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组达到高峰,胞体更大,突起更粗更长交织成网;14d时两组BLBP阳性细胞的比例均稍有降低,但诱导组的比例仍明显高于对照组,两组细胞的胞体稍变小,突起稍变细变短。上述结果提示,切割穹窿海马伞侧海马提取液可明显地诱导BLBP阳性放射状胶质细胞增殖,并使胞体变大,突起变粗变长,呈"激活"状态。

穹窿海马伞切割大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割海马伞后1、3、7、14、21及28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA表达水平的变化。结果海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,14 d达到最高水平,随后下降,28 d左右恢复至正常水平。结论切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调,可能与促进神经干细胞更多地向神经元和AChE阳性神经元分化有关。

大鼠创伤性脑损伤后星形胶质细胞的变化

目的:探讨大鼠创伤性脑损伤后星形胶质细胞的形态学变化及GFAP和NOS的表达情况。方法:采用大鼠自由落体脑损伤模型,伤后1、3、7d取脑切片,行Nissl染色以及GFAP免疫组化和NADPH-d组化单标记及双标记染色。结果:损伤区周围皮质GFAP阳性细胞胞体增大、突起增粗增长,GFAP阳性细胞数量与正常侧及对照组相比,伤后1d即有明显增加,伤后3d、7d数量持续增加;损伤侧海马CA1￣3区和DG各层GFAP阳性细胞排列紊乱,胞体增大、突起增粗增长,GFAP阳性细胞数量与正常侧及对照组相比则无明显变化。损伤区周围皮质、损伤侧海马NOS阳性细胞数量明显增加。伤后3d损伤区周围皮质和损伤侧海马中GFAP与NOS双标细胞分别占GFAP阳性细胞的14.2%和13.4%左右。结论:大鼠创伤性脑损伤后大量的星形胶质细胞活化、GFAP表达增加并且部分转化为NOS阳性细胞,提示其参与了脑组织的损伤与修复过程。

大鼠皮质脊髓束Luxol Fast Blue染色

目的:探讨显示大鼠皮质脊髓束的特殊染色方法。方法:选用正常成年SD大鼠延髓和脊髓冰冻切片,应用Luxol Fast Blue染色法进行染色。结果:Luxol Fast Blue染色后,在延髓和脊髓切片中可见灰质呈淡红色,白质呈蓝色,延髓锥体染成深蓝色。锥体中Luxol Fast Blue标记的深蓝色阳性纤维,经锥体交叉后至脊髓灰质后连合背侧,沿脊髓后索腹侧深层下行,至荐段后逐渐消失。在延髓锥体和脊髓颈、胸、腰段后索中,深蓝色的Luxol Fast Blue阳性纤维边界清晰,与周围结构区分明显。结论:运用Luxol Fast Blue染色可清楚显示大鼠皮质脊髓束在脊髓内的定位,是一种简便可靠的皮质脊髓束形态学研究方法。

原位杂交法检测切割穹窿海马伞大鼠海马中PEBP mRNA的表达

目的:探讨切割穹窿海马伞侧大鼠海马与正常侧海马中PEBP mRNA的表达差异。方法:取6只大鼠,于切割右侧穹窿海马伞后第7d,应用寡核苷酸探针原位杂交技术观察PEBP mRNA在切割侧和正常侧海马中的表达差异。结果:切割侧锥体细胞层和齿状回颗粒层PEBP mRNA阳性细胞数量与正常侧比较无明显差异(P>0.05),但切割侧的杂交信号强于正常侧(P<0.05);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧PEBP mRNA阳性细胞数量多于正常侧,杂交信号也强于正常侧(P<0.05)。结论:结合本课题组以往的工作,切割穹窿海马伞后海马内PEBP mRNA的表达上调,可能与海马内神经干细胞向胆碱能神经元的分化有关。

壳聚糖作载体的NSCs移植对大鼠脑损伤区胶质增生的抑制作用

目的:探讨壳聚糖作载体的神经干细胞(NSCs)移植对大鼠创伤性脑损伤(TBI)区胶质增生的抑制作用。方法:用低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs进行扩增传代。Feeney法制备SD大鼠TBI模型12只,随机均分为2组:损伤对照组和NSCs+支架移植组2组。术后3个月取脑切片行Nissl染色、GFAP免疫荧光染色,观察两组损伤区和海马变化以及损伤区周边星形胶质细胞增生情况。结果:Nissl染色见损伤对照组创伤区形成烧杯状空洞,损伤侧海马萎缩变形,而NSCs+支架移植组创伤区有移植物填充且已与宿主整合,损伤侧海马萎缩不明显。GFAP免疫荧光染色,损伤对照组创伤区周边可见到大量GFAP阳性细胞,荧光强度较强,疤痕较宽,而NSCs+支架移植组创伤区周边仅见到少量的GFAP阳性细胞,荧光强度弱,疤痕较窄。t检验结果显示两组损伤区周围GFAP免疫荧光的灰度值、胶质疤痕宽度有显著性差异(P<0.01)。结论:大鼠TBI后行壳聚糖作载体的NSCs移植治疗可以抑制脑损伤区胶质增生,从而促进脑损伤的修复。

切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化——原位杂交法

目的探讨大鼠穹隆海马伞切割侧与正常侧海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法切割大鼠右侧穹窿海马伞,切割后14d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Brn-4 RNA探针进行原位杂交。每只动物随机计数3张切片切割侧和正常侧Brn-4 mRNA的阳性细胞,测定其吸光度(A)值,进行配对t检验分析。结果切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层均见Brn-4 mRNA阳性细胞,两侧细胞数无明显差异,但切割侧阳性细胞平均吸光度值较正常侧明显增加(P<0.01);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧Brn-4 mRNA阳性细胞数和平均吸光度值均较正常侧升高(均P<0.01)。结论穹窿海马伞切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞中Brn-4 mRNA的表达量明显增强,而在齿状回门区和颗粒下层中,其阳性细胞数和表达量均较正常侧明显升高。结合本课题组以往的工作,提示切割穹窿海马伞后,海马中Brn-4 mRNA表达的增高可能与促进其中的神经干细胞向神经元分化有关。

大鼠中脑发育早期Nurr1时空模式及与TH表达的相关性

目的:观察孤儿核受体相关因子1(Nuclear receptor-related factor1,Nurr1)在大鼠胚胎中脑发育过程中的时空表达模式及与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的相关性。方法:制备大鼠胚胎E12.5、E13.5、E14.5d中脑脑片,行Nurr1/TH的免疫荧光双标记。在荧光显微镜下分别计数每个视野下TH、Nurr1单标神经元和Nurr1/TH双标神经元的数量,用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果:Nurr1/TH双标神经元在E12.5d时较少,随着发育时间的推移逐渐增加,至E14.5d时TH阳性细胞中几乎均有Nurr1的表达。结论:本研究结果进一步从形态学的角度提示转录因子Nurr1在胚胎发育过程中对中脑多巴胺(dopamine,DA)能神经元的发育起重要作用。

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后的PEBP mRNA表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞侧海马提取液对海马放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)mRNA表达的影响。方法:将培养的海马胶质细胞接种于培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液。培养7d后,提取总RNA,然后逆转录合成cDNA,用real-timePCR观察诱导组及切割组中PEBPmRNA的表达情况。结果:PEBPmRNA在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加(P<0.05)。结论:表达增加的PEBPmRNA可能与切割侧海马提取液"激活"的放射状胶质细胞向胆碱能神经元分化有关。

实时聚合酶链反应检测切割穹窿海马伞大鼠海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)mRNA的表达差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹隆海马伞后1、3、7、14、21及28d组,每组6只。提取各组大鼠的海马组织总RNA,应用实时PCR技术观察切割穹窿海马伞后海马中PEBPmRNA的表达变化。结果PEBPmRNA在切割后3d表达开始上升,7d达最高水平,随后缓慢下降,21d时降至正常。结论切割穹窿海马伞后海马中PEBP的高表达可能与诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的海马神经再生有关。