神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响。方法12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液,并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU。于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无。结论切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加NGF可促进其增殖和分化。

穹窿海马伞切割后海马内NSCs的增殖和向神经元的分化

目的观察切割穹窿海马伞侧和非切割侧大鼠海马内自体神经干细胞的增殖和向神经元分化的情况。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,术后2 d腹腔注射BrdU,连续5d,于术后28 d取脑冰冻切片,进行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果切割穹窿海马伞侧海马内的BrdU免疫荧光阳性细胞明显多于非切割侧,且发现有BrdU/NF-200双标神经元,而非切割侧未见到BrdU/NF-200双标神经元。结论穹窿海马伞切割后,切割侧海马内自体神经干细胞增殖加快,并可向神经元分化。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

丽春红2R-亮绿法在中枢神经纤维束髓鞘染色中的应用

目的:探索一种中枢神经纤维束髓鞘的染色方法。方法:应用丽春红2R-亮绿双重染色法,对正常SD大鼠脊髓组织进行染色。结果:丽春红2R-亮绿染色后,脊髓白质中神经纤维束轴索、髓鞘呈橙红色,灰质背景呈淡绿色,其中神经元呈绿色。结论:丽春红2R-亮绿法是显示中枢神经纤维束的一种简便、迅速、可靠染色法。

PKCγ免疫反应定位小鼠皮质脊髓束的实验研究

目的探讨显示皮质脊髓束在成年小鼠脑和脊髓中定位分布的简便有效方法。方法运用蛋白激酶Cγ(PKCγ)免疫组织化学染色法,观察成年ICR小鼠脑和脊髓中皮质脊髓束的定位和分布情况。结果PKCγ免疫阳性产物分布于大脑运动皮层第V层锥体细胞胞体和轴突中,锥体细胞的阳性纤维经内囊、中脑大脑脚底、脑桥基底部、下行至延髓锥体中。在延髓下段,PKCγ阳性纤维经锥体交叉后进入对侧脊髓灰质后联合背侧,形成背侧皮质脊髓束,在脊髓白质的后索腹侧深层下行,至骶髓3-4节段以下逐渐消失。在整个脊髓前索和外侧索中未见有PKCγ阳性纤维。结论PKCγ特异地表达于脊髓后索皮质脊髓束中,提示PKCγ免疫组织化学法是一种显示和观察皮质脊髓束精确定位的有效方法。

采用Photoshop软件对成年SD大鼠脊髓中皮质脊髓束三维重建的研究

目的利用大鼠脊髓连续切片,结合三维重建工具软件对正常大鼠皮质脊髓束进行三维重建。方法制作正常成年SD大鼠脊髓连续横断切片,进行Luxol快蓝（LFB）染色并摄片,获得大鼠脊髓皮质脊髓束连续切片图像。在Photoshop软件环境下完成切片图像的配准、分割、灰度化。利用3D-DOCTOR软件进行阈值分割并对大鼠脊髓、脊髓灰质、双侧皮质脊髓束结构进行三维重建,在普通台式机（PC）上对重建结构进行任意角度的观察、切割和测量。结果重建出的大鼠脊髓、脊髓灰质、双侧皮质脊髓束具有立体感,大鼠皮质脊髓束于大鼠颈1节段（C1）～骶4节段（S4）走行于大鼠脊髓后索腹侧,紧贴灰质中间带背侧,呈逐渐变细的类圆柱状形态。在PC机中进行切割后可以对切割后剩余结构进行表面积和体积的数据测量。结论利用大鼠脊髓的连续LFB染色切片,结合计算机三维重建技术,能够进行大鼠皮质脊髓束的三维重建,并提供测量数据。

MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区小胶质细胞反应性差异研究

为了探讨Parkinson病(PD)小鼠相关脑区的小胶质细胞反应性是否存在差异,本研究采用MPTP诱导的小鼠PD模型,用GSA I-B4-HRP组织化学染色方法对黑质致密部(SNc)、尾壳核(CPu)、腹侧被盖区(VTA)和额叶联合皮层(FrA)四个部位中小胶质细胞的形态和数量进行了观察;同时用免疫荧光染色检测了SNc和VTA中TH阳性神经元的数量,用Western blot方法检测CPu和FrA内TH蛋白含量的变化情况。结果显示:SNc中TH阳性神经元的数量和CPu中TH蛋白的含量在MPTP腹腔注射后1 d即大幅度降低(降幅约为68%);在MPTP腹腔注射后3 d起SNc中TH阳性神经元的数量和CPu中TH蛋白的含量逐步增加;小胶质细胞在MPTP腹腔注射后1～3 d的反应明显,然后逐渐减弱。VTA中TH阳性神经元的数量和FrA中TH蛋白的含量在MPTP腹腔注射后降幅不明显(降幅约在15%),小胶质细胞在MPTP腹腔注射后1 d的反应较为明显,其它时段的变化不显著。本研究结果提示:PD模型小鼠SNc和CPu中的小胶质细胞反应明显强于VTA和FrA区,反应性小胶质细胞在SNc中的多巴胺(DA)能神经元损伤过程中扮演了重要角色。

6-OHDA诱导大鼠不同脑区星形胶质细胞反应差异的研究

目的:观察大鼠不同脑区中的星形胶质细胞对6-羟多巴(6-OHDA)局部注射反应的差异。方法:将6-OHDA局部注入大鼠脑内黑质致密部(SNc)、纹状体(CPu)、腹侧被盖区(VTA)和额叶联合皮层(FrA),用免疫组织化学方法观察这些脑区中星形胶质细胞的变化。结果:6-OHDA注入1d后各脑区星形胶质细胞反应较轻,7d后反应明显,并持续至14d;各组相比较以SNc组和VTA组反应明显,而CPu组和FrA组反应较轻。结论:大鼠不同脑区中的星形胶质细胞对6-OHDA局部注射后的反应存在差异。

蛋白激酶Cγ在成年大鼠延髓和脊髓白质中的分布

目的观察蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)在成年大鼠延髓和脊髓白质内的分布。方法免疫组织化学ABC法显示PKCγ免疫阳性物质在延髓和脊髓颈、胸、腰、骶段白质内的表达和分布。结果PKCγ免疫阳性物质分布于锥体、锥体交叉及脊髓颈、胸、腰、骶段后索腹侧中;延髓和脊髓背角神经元中也有PKCγ免疫阳性物质存在。结论PKCγ免疫阳性反应产物广泛分布于成年大鼠延髓和脊髓白质内的皮质脊髓束中。PKCγ免疫阳性反应产物在延髓锥体和脊髓后索内的定位与大鼠皮质脊髓束的位置和走行一致,提示其在运动神经传导通路中可能起着重要作用。

MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中相关脑区iNOS时程表达变化

目的:观察1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小鼠急性损伤PD模型中纹状体(CPu)、黑质致密部(SNpc)、额叶皮层联合区(FrA)和腹侧被盖区(VTA)中iNOS基因和蛋白的时程表达变化。方法:用RT-PCR和Western blot方法对MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区iNOS基因和蛋白的表达量进行检测。结果:MPTP诱导的小鼠PD模型中SNpc和CPu脑区iNOS基因和蛋白在给药后多个时间点均有显著性表达,其中1d是表达高峰;VTA和FrA脑区iNOS基因和蛋白的表达没有SNpc和CPu脑区表达显著。结论:表达增高的iNOS可能对SNpc和VTA脑区DA能神经元及CPu和FrA脑区的DA能神经元末梢起了损伤作用,从而导致了DA能神经元的减少及其末梢退变的发生。

RT-PCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法:36只SD大鼠随机分成6组,每组6只。1组为正常对照组,其余5组分别为切割穹窿海马伞后3、7、14、21和28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹隆海马伞切割后海马内Lhx8 mRNA的表达变化。结果:海马内Lhx8 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,7 d时达到最高水平,以后逐渐下降,于28 d时恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关。

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后PEBP蛋白的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞的侧海马提取液对放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)表达的影响。方法:将培养的海马放射状胶质细胞接种于培养板中,分成对照组和诱导组,对照组中加入含5%正常海马提取液的DMEM/F12细胞培养液,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液。培养7 d后,通过免疫荧光标记法观察PEBP在放射状胶质细胞中的表达,并提取总蛋白,采用Western blot的方法观察对照组及诱导组中PEBP蛋白的表达变化。结果:PEBP蛋白在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加(P<0.05)。结论:PEBP的表达增加可能与切割侧海马提取液"激活"的放射状胶质细胞向神经元分化有关。

Nurr1和TH mRNA在PD模型大鼠黑质中的表达变化

目的探讨单侧帕金森病(PD)模型大鼠黑质中内源性孤儿核受体(Nurr1)和酪氨酸羟化酶(TH)mRNA表达的变化及其相关性。方法用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射至成年大鼠右侧前脑内侧束(MFB)制备单侧帕金森病模型,于术后1、7、14、28 d分别采用半定量RT-PCR和原位杂交方法检测双侧黑质中Nurr1和TH mRNA表达的变化。结果Nurr1 mRNA表达在术后1 d损伤侧黑质中即明显下降,术后7 d开始逐渐增加,14 d接近正常水平,28 d明显升高。除14 d组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。而TH mRNA表达在术后1 d损伤侧黑质中无明显变化,7 d后开始下降,14 d达最低,28 d开始上升。除1d组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间的差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论Nurr1mRNA在多巴胺能表型神经元的损伤和再生修复中发挥重要的作用。

大鼠皮质脊髓束选择性横断损伤模型的建立

目的建立一种稳定可靠且简便实用的皮质脊髓束选择性横断损伤动物模型。方法选择在延髓锥体切断左侧锥体束,制作大鼠皮质脊髓束选择性横断损伤模型。采用Rivlin斜板实验评价模型的运动功能,运用Luxolfast blue(LFB)染色法、生物素化葡聚糖胺(BDA)神经示踪法和蛋白激酶Cγ(PKCγ)免疫组织化学染色法观察皮质脊髓束的形态学变化。结果皮质脊髓束损伤组大鼠术后右侧前后肢瘫痪,运动功能受限,Rivlin试验显示倾斜平面临界角度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);损伤区未见LFB阳性神经纤维束通过;在延髓锥体交叉平面,仅见一束BDA或PKCγ阳性纤维束经右侧锥体交叉至脊髓后索,在左侧脊髓后索最深层,紧邻脊髓灰质后连合背侧下行至骶段,而在损伤平面以下,未见有BDA或PKCγ阳性纤维束经左侧锥体交叉至右侧,在整个脊髓后索的右侧半未见有BDA或PKCγ阳性纤维束。结论选择在延髓切断一侧锥体束,建立皮质脊髓束选择性横断损伤模型,方法简便实用,结果稳定可靠,是研究皮质脊髓束的可塑性和神经轴突再生的理想动物模型。

大鼠创伤性脑损伤后创伤区周围皮质细胞聚二磷酸腺苷核糖多聚酶的表达

目的观察大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围皮质不同时点聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)阳性细胞的表达变化。方法采用大鼠自由落体脑损伤模型,伤后2、6、12、24、72、168 h取脑切片,行PARP、β-Tubline-Ⅲ、Hoechst荧光检测。结果损伤区周围于伤后2 h即可观察到PARP阳性细胞,主要出现在大脑皮质第3层,6 h数量达到第1个高峰;后PARF阳性细胞出现部位逐渐向深部迁移,至伤后72 h数量达到第2个高峰,表达部位主要位于大脑皮质第5层。伤后各时点均可观察到部分PARP、β-TubulinⅢ双标阳性细胞,其核hoechst着色不均匀,表达变化趋势与PARP阳性细胞基本一致。结论大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围PARP阳性细胞数量的变化与伤后时程有关,表达部位逐渐远离损伤区,PARP阳性细胞部分为凋亡的神经元。