Genistein对去卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元影响的体内研究

本文旨在研究染料木素(genistein)对去卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元的影响。雌性大鼠双侧卵巢切除2周后用genistein和雌激素替代治疗1周。称子宫重量以确定手术是否成功及雌二醇(E2)的治疗是否有效。用免疫组化染色、RT-PCR和Westernblot等方法对胆碱能神经元数量、ChAT基因和蛋白的表达量进行检测。结果显示:去卵巢3周后子宫变轻,雌激素替代治疗能增加去卵巢子宫的重量,而genistein替代治疗对去卵巢子宫的重量影响不明显;去卵巢3周后,内侧隔核(MS)和斜角带垂直臂核(VDB)内的胆碱能神经元数量、ChAT基因和蛋白的表达量均明显减少,雌激素和genistein替代治疗后能显著增加去卵巢大鼠MS和VDB内的胆碱能神经元数量、ChAT基因和蛋白的表达量。本研究结果提示:genistein对去卵巢大鼠基底前脑胆碱能神经元具有类似雌激素样神经保护作用,而对子宫影响不明显。

Genistein对大鼠基底前脑胆碱能神经元发育影响的体外研究

本文旨在研究染料木素(genistein)对体外培养的基底前脑胆碱能神经元发育的影响。取孕18d胎鼠基底前脑神经元,体外有血清培养7d后,随机分为3组:无血清培养液组(control组),genistein+无血清培养液组(G组)、E2+无血清培养液组(E2组)。48h后用MTT法测定细胞活力和代谢状态;用AChE组化染色以及ChAT和MAP2免疫荧光双重染色,镜下计数AChE阳性和ChAT阳性神经元数,并对两种神经元的细胞面积、第一级突起数及最长突起长度进行检测。结果显示:MTT法所测的OD值、AChE阳性和ChAT阳性神经元数、细胞面积、第一级突起数及最长突起长度在G组与control组之间无明显差异,然而E2组中的上述数值均明显增加。本研究的结果提示:genistein对体外培养的基底前脑胆碱能神经元无类似雌激素样的神经保护和营养作用。

染料木素对去卵巢大鼠基底前脑神经元型一氧化氮合酶神经元影响的体内研究

目的研究染料木素对去卵巢大鼠基底前脑神经元型一氧化氮合酶(nNOS)神经元的影响。方法对雌性大鼠双侧卵巢切除2周后行Genistein和雌激素替代治疗4周。用免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot方法对nNOS神经元数量、nNOS基因和蛋白的表达量进行检测。结果去卵巢6周后,基底前脑内侧隔核(MS)和斜角带核垂直支(VDB)部位的nNOS神经元数量、nNOS基因和蛋白的表达量均明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);雌激素和Genistein替代治疗后能显著增加去卵巢大鼠该部位的nNOS神经元数量、nNOS基因和蛋白的表达量,差异有统计这意义(P<0.05)。结论Genistein对去卵巢大鼠基底前脑nNOS神经元具有类似雌激素样神经保护作用。

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响。方法12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液,并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU。于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无。结论切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加NGF可促进其增殖和分化。

穹窿海马伞切割后海马内NSCs的增殖和向神经元的分化

目的观察切割穹窿海马伞侧和非切割侧大鼠海马内自体神经干细胞的增殖和向神经元分化的情况。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,术后2 d腹腔注射BrdU,连续5d,于术后28 d取脑冰冻切片,进行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果切割穹窿海马伞侧海马内的BrdU免疫荧光阳性细胞明显多于非切割侧,且发现有BrdU/NF-200双标神经元,而非切割侧未见到BrdU/NF-200双标神经元。结论穹窿海马伞切割后,切割侧海马内自体神经干细胞增殖加快,并可向神经元分化。

Brn-4抗体对大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备成年SD大鼠海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离、克隆和扩增的神经干细胞球分成6组:(1)切割组:加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(2)切割阻断组:在切割组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(3)正常组:加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(4)正常阻断组:在正常组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(5)空白组:加入单纯的DMEM/F12培养基;(6)空白阻断组:在空白组培养基中加入Brn-4多克隆抗体。培养后第14d对NSCs分化的神经元进行MAP-2免疫荧光检测,图像处理系统计数各组MAP-2阳性神经元数、处理胞体面积和细胞周长,STATA7.0软件进行统计分析。结果显示:各组以上三项形态学指标从优到劣的排列顺序为:切割组、正常组、切割阻断组、正常阻断组、空白组和空白阻断组。统计分析结果表明,除空白组与空白阻断组三项指标无显著性差异外,其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05)。上述结果提示,Brn-4多克隆抗体在体外能部分地阻断切割海马伞侧海马提取液促进NSCs向神经元分化的作用,因而Brn-4在海马NSCs向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

核受体相关因子1基因过表达诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元

目的探讨核受体相关因子1(Nurr1)基因对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法通过基因重组技术构建pEGFP-N1-Nurr1真核表达载体,用电穿孔法将重组质粒转染第3代NSCs,用荧光显微镜观察转染效率,免疫印迹法检测基因表达效果;并对转染后的NSCs进行体外分化培养3周,用免疫荧光双标技术检测酪氨酸羟化酶(TH)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果电穿孔法转染NSCs48h后转染效率达35%,1周后免疫印迹法检测到Nurr1蛋白高表达,约为对照组的5倍;Nurr1基因转染的NSCs分化为TH阳性神经元的比率为15.45%,明显高于对照组,而MAP-2阳性神经元数量与对照组相似。结论 Nurr1基因过表达可以诱导NSCs向TH阳性的多巴胺能神经元分化。

采用Photoshop软件对成年SD大鼠脊髓中皮质脊髓束三维重建的研究

目的利用大鼠脊髓连续切片,结合三维重建工具软件对正常大鼠皮质脊髓束进行三维重建。方法制作正常成年SD大鼠脊髓连续横断切片,进行Luxol快蓝（LFB）染色并摄片,获得大鼠脊髓皮质脊髓束连续切片图像。在Photoshop软件环境下完成切片图像的配准、分割、灰度化。利用3D-DOCTOR软件进行阈值分割并对大鼠脊髓、脊髓灰质、双侧皮质脊髓束结构进行三维重建,在普通台式机（PC）上对重建结构进行任意角度的观察、切割和测量。结果重建出的大鼠脊髓、脊髓灰质、双侧皮质脊髓束具有立体感,大鼠皮质脊髓束于大鼠颈1节段（C1）～骶4节段（S4）走行于大鼠脊髓后索腹侧,紧贴灰质中间带背侧,呈逐渐变细的类圆柱状形态。在PC机中进行切割后可以对切割后剩余结构进行表面积和体积的数据测量。结论利用大鼠脊髓的连续LFB染色切片,结合计算机三维重建技术,能够进行大鼠皮质脊髓束的三维重建,并提供测量数据。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

骨髓基质细胞脑室内移植对脑外伤后神经功能障碍的治疗作用

目的:探讨骨髓基质细胞(MSCs)移植到实验性脑外伤大鼠侧脑室后对神经功能障碍的治疗作用。方法:从GFP转基因SD大鼠分离MSCs,体外扩增至第五代。取SD大鼠96只,供制作模型。其中随机选取24只作为正常对照组,72只采用Feeney自由落体方法建立大鼠脑外伤模型,造模后7 d,随机分为三组:MSCs治疗组、IMDM对照组、TBI对照组,每组24只。MSCs治疗组经侧脑室移植MSCs,IMDM对照组经侧脑室注射同体积的IMDM基础培养液,TBI对照组经侧脑室空白进针,分别于移植后2、4、8、12周末,以神经功能评分和免疫荧光染色评价MSCs移植后对大鼠神经功能的改善情况和在大鼠脑内存活迁移情况。结果:经侧脑室移植的MSCs可向脑损伤区域迁移,少数能表达一些神经元和星形胶质细胞的特异性标志物,如NeuN和GFAP。侧脑室移植MSCs治疗组大鼠神经功能恢复的程度优于侧脑室注射IMDM对照组和TBI对照组,有统计学差异(P<0.05),IMDM对照组和TBI对照组神经功能恢复的程度相比无明显差异(P>0.05)。结论:MSCs通过侧脑室同种异体移植后能存活并向损伤区域迁移聚集,少数可分化为神经元和星形胶质细胞,可促进外伤性脑损伤所造成的神经功能障碍的恢复。

生物素化葡聚糖胺顺行追踪标记大鼠皮质脊髓束

目的:探讨生物素化葡聚糖胺(BDA)对皮质脊髓束(CST)示踪的应用价值。方法:采用成年SD大鼠40只,随机分为单侧锥体束损伤组(n=24)、假损伤组(n=8)和正常组(n=8)。在锥体交叉上方选择性切断左侧锥体建立单侧锥体束横断损伤模型。运用Rivlin斜板试验进行运动功能检测。在双侧感觉运动皮层多点分层立体定位注射BDA,BDA注射14天后取脑和脊髓切片进行ABC免疫组织化学染色显示BDA标记信号,观察皮质脊髓束的走行。结果:Rivlin斜板试验显示单侧锥体束横断损伤组倾斜平面临界角度变化明显小于正常对照组和假损伤组(P<0.05)。正常组和假损伤组大鼠BDA示踪显示BDA标记阳性细胞定位于双侧感觉运动皮层的锥体细胞,锥体细胞发出的BDA阳性纤维束对称分布于双侧皮层、内囊、大脑脚、脑桥基底部、延髓锥体中的皮质脊髓束内,继而经锥体交叉到脊髓后索,在双侧后索最深层、灰质后连合背侧下行至脊髓骶段。锥体束横断损伤大鼠在损伤部位以上可见双侧对称的BDA阳性纤维束,损伤平面以下在右侧延髓锥体和左侧脊髓后索中见有BDA阳性纤维束,损伤侧锥体和右侧脊髓后索中未见有BDA阳性纤维束。结论:BDA顺行示踪技术可以清楚地显示皮质脊髓束,对皮质脊髓束损伤与修复的形态学研究具有较好的应用价值。

丽春红2R-亮绿染色法显示大鼠皮质脊髓束的实验研究

目的:探索显示和区分皮质脊髓束在大鼠脑干和脊髓内定位的染色方法。方法:通过丽春红2R-亮绿双重染色法对正常SD大鼠延髓、脊髓(颈5、胸10、腰3、骶2节段)组织切片进行染色。结果:丽春红2R-亮绿染色后,延髓和脊髓白质中神经纤维束轴索、髓鞘呈橙红色,灰质背景呈淡绿色,其中神经元呈绿色。在延髓锥体、锥体交叉中及在脊髓颈、胸段后索腹侧最深层可见皮质脊髓束染成橙红色,着色略深,与其背侧的薄束和腹侧的灰质界限分明、对比清晰。结论:丽春红2R-亮绿染色法可以清楚地显示成年大鼠皮质脊髓束在脑干和脊髓内的位置,为中枢神经损伤与修复研究提供一种简便、快速、可靠的神经纤维束定位染色方法。

大鼠锥体束显微结构的三维重建方法研究

目的:探讨构建神经纤维束显微结构三维可视化模型的实用方法。方法:SD大鼠全脑连续冰冻切片经Luxol Fast Blue染色显示锥体束。采用分区显微摄影法,获取每张脑组织切片的二维图像。运用Photoshop 7.0软件对每张脑片的图像进行拼接,根据三轴定位法对拼接图像进行配准,导入3D-DOCTOR4.0软件对脑和锥体束进行表面重建和体素重建。利用3DMAX8.0软件对重建模型进行可视化处理。结果:重建出SD大鼠脑和锥体束全貌模型清晰逼真,可以在任意断面从不同角度观察锥体束的显微结构,动态显示锥体束在脑内的立体行径。结论:基于连续组织切片的三轴定位法结合三维重建软件可以真实地再现锥体束的显微结构及其在脑内的三维立体行径,为神经纤维束的损伤修复研究提供精确的三维立体形态学基础。

丽春红2R-亮绿法在中枢神经纤维束髓鞘染色中的应用

目的:探索一种中枢神经纤维束髓鞘的染色方法。方法:应用丽春红2R-亮绿双重染色法,对正常SD大鼠脊髓组织进行染色。结果:丽春红2R-亮绿染色后,脊髓白质中神经纤维束轴索、髓鞘呈橙红色,灰质背景呈淡绿色,其中神经元呈绿色。结论:丽春红2R-亮绿法是显示中枢神经纤维束的一种简便、迅速、可靠染色法。

MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区小胶质细胞反应性差异研究

为了探讨Parkinson病(PD)小鼠相关脑区的小胶质细胞反应性是否存在差异,本研究采用MPTP诱导的小鼠PD模型,用GSA I-B4-HRP组织化学染色方法对黑质致密部(SNc)、尾壳核(CPu)、腹侧被盖区(VTA)和额叶联合皮层(FrA)四个部位中小胶质细胞的形态和数量进行了观察;同时用免疫荧光染色检测了SNc和VTA中TH阳性神经元的数量,用Western blot方法检测CPu和FrA内TH蛋白含量的变化情况。结果显示:SNc中TH阳性神经元的数量和CPu中TH蛋白的含量在MPTP腹腔注射后1 d即大幅度降低(降幅约为68%);在MPTP腹腔注射后3 d起SNc中TH阳性神经元的数量和CPu中TH蛋白的含量逐步增加;小胶质细胞在MPTP腹腔注射后1～3 d的反应明显,然后逐渐减弱。VTA中TH阳性神经元的数量和FrA中TH蛋白的含量在MPTP腹腔注射后降幅不明显(降幅约在15%),小胶质细胞在MPTP腹腔注射后1 d的反应较为明显,其它时段的变化不显著。本研究结果提示:PD模型小鼠SNc和CPu中的小胶质细胞反应明显强于VTA和FrA区,反应性小胶质细胞在SNc中的多巴胺(DA)能神经元损伤过程中扮演了重要角色。

PKCγ免疫反应定位小鼠皮质脊髓束的实验研究

目的探讨显示皮质脊髓束在成年小鼠脑和脊髓中定位分布的简便有效方法。方法运用蛋白激酶Cγ(PKCγ)免疫组织化学染色法,观察成年ICR小鼠脑和脊髓中皮质脊髓束的定位和分布情况。结果PKCγ免疫阳性产物分布于大脑运动皮层第V层锥体细胞胞体和轴突中,锥体细胞的阳性纤维经内囊、中脑大脑脚底、脑桥基底部、下行至延髓锥体中。在延髓下段,PKCγ阳性纤维经锥体交叉后进入对侧脊髓灰质后联合背侧,形成背侧皮质脊髓束,在脊髓白质的后索腹侧深层下行,至骶髓3-4节段以下逐渐消失。在整个脊髓前索和外侧索中未见有PKCγ阳性纤维。结论PKCγ特异地表达于脊髓后索皮质脊髓束中,提示PKCγ免疫组织化学法是一种显示和观察皮质脊髓束精确定位的有效方法。

6-OHDA诱导大鼠不同脑区星形胶质细胞反应差异的研究

目的:观察大鼠不同脑区中的星形胶质细胞对6-羟多巴(6-OHDA)局部注射反应的差异。方法:将6-OHDA局部注入大鼠脑内黑质致密部(SNc)、纹状体(CPu)、腹侧被盖区(VTA)和额叶联合皮层(FrA),用免疫组织化学方法观察这些脑区中星形胶质细胞的变化。结果:6-OHDA注入1d后各脑区星形胶质细胞反应较轻,7d后反应明显,并持续至14d;各组相比较以SNc组和VTA组反应明显,而CPu组和FrA组反应较轻。结论:大鼠不同脑区中的星形胶质细胞对6-OHDA局部注射后的反应存在差异。

NGF诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用

目的:探讨大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞在NGF的诱导下分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。方法:应用无血清培养技术,分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞,然后在含或不含NGF的培养液中分化14d。用MAP-2免疫荧光和AChE组化技术检测神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。并对MAP-2阳性神经元的分化率、AChE阳性神经元数及其它们的细胞面积和周长进行图像处理;用STATA7.0统计软件进行方差分析和两两比较。结果:隔区和皮层NGF组MAP-2阳性神经元分化率高于隔区和皮层对照组;其细胞面积除隔区NGF组与皮层NGF组之外,其它各组间差异均有统计学意义;而其周长各组之间差异均有统计学意义。AChE阳性神经元的数量及细胞面积和周长,隔区NGF组最佳,皮层NGF组次之,隔区对照组再次之,皮层对照组较差。三项指标各组间差异有统计学意义。结论:NGF可诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元分化;隔区神经干细胞较皮层神经干细胞更易于向AChE阳性神经元分化;这种区域特异性可在NGF诱导下发生改变。

PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

切割大鼠右侧穹窿海马伞,应用Western blot、免疫组化技术,观察切割后海马中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyle-thanolamine binding protein,PEBP)的表达的时空变化。Western blot结果显示:PEBP在切割后3 d表达开始上升,7 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常。免疫组化结果显示:术后各时间点切割侧海马CA1～CA3区的锥体细胞层和齿状回颗粒层的PEBP阳性细胞数与正常侧相比无显著性差异(P>0.05),但切割侧PEBP阳性细胞染色加深,7 d时最为明显,两侧比较灰度值有显著性差异(P<0.01)。切割侧齿状回门区和颗粒下层中可见较多深染的PEBP阳性细胞,其细胞数和灰度值与正常侧相比均有显著性差异(P<0.05)。结合本课题组以往的工作,本结果提示切割穹窿海马伞后PEBP的高表达可能与海马神经再生有关。

一种基于大鼠颈髓连续切片的计算机三维重建方法

目的以个人计算机(PC)为平台,探讨一种基于大鼠颈髓切片进行脊髓三维重建方法。方法制作正常SD大鼠颈髓节段包埋蜡块,于颈髓标本四周进行外定位标记,Leica石蜡切片机进行连续横断切片,每切3张,用CANON数码相机对蜡块中的颈髓标本及其外定位标记进行摄片,获得连续切片图像。所得图像进行排序,裁切,转换为灰度图像并进行背景不均匀校正后,利用3D-DOCTOR软件对每张图像上的颈髓、颈髓灰质及定位孔进行边缘提取,利用定位孔对连续图像进行自动配准,三维表面重建后在PC机上进行任意角度观察、切割和测量。结果利用大鼠颈髓连续切面图像重建得到大鼠颈髓白质和灰质,并对其进行测量,获得了表面积和体积等数据。结论利用石蜡包埋和"硬"定位技术可以获得颈髓节段连续横断切面图像,进行三维重建并对重建结构进行自由观察和测量。