医学留学生生物化学实验教学的实践与探索

随着国际交流与合作的日益频繁,留学生教育已成为中国高等教育的一个重要组成部分,生物化学实验是医学留学生的必修重要课程之一,因此,生物化学实验课的教学质量对学生的全面发展非常重要。通过对留学生生物化学实验教学的实践,根据留学生自身的特点和生物化学实验课程的特点,对我校留学生的生物化学实验教学进行了有益的实践与探索。结果显示留学生生物化学实验课的教学质量取得了显著提高。

医学留学生生物化学教学实践

留学生教学的研究成为各高校一个崭新的课题，其教学模式、教学方法及教学手段等问题都具有极大的探索价值。生物化学是医学生就学期间一门重要的基础科目，留学生教学要从适应留学生需求出发。通过对教学语言、教学内容、教学方法的改进，努力提高医学留学生生物化学的教学质量。

医学本科生分子生物学实验教学体会

为使本科生掌握分子生物学的基本技术,实验室进行了生物化学实验改革,对多个专业的本科生开设部分分子生物学实验,使学生增加了对新技术的认识和理解,提高了综合素质.

糖元合成酶激酶3β对微管相关蛋白tau的磷酸化作用

tau蛋白是中枢神经系统中重要的微管相关蛋白,其功能受磷酸化调节.异常过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病患者脑中神经纤维缠结的主要组成部分.糖元合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是重要的tau蛋白激酶之一,它虽可催化tau蛋白多个位点的磷酸化,但对不同位点,其催化效率不同.通过位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,用免疫印迹技术,检测GSK-3β对tau蛋白位点特异性的磷酸化作用及动力学.用双倒数作图,计算GSK-3β催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞中的实验,研究GSK-3β对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性.结果显示,GSK-3β催化tau蛋白多个位点的磷酸化,其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396和Ser404,对不同的位点磷酸化作用,其Km值不同,GSK-3β对Ser396的Km值最低,即对Ser396位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强.在培养的细胞中,也显示了GSK-3β的表达引起Ser396位点的磷酸化最明显.

艾迪注射液对肺癌细胞A549放射增敏作用的实验研究

目的研究艾迪注射液对人肺腺癌细A549放射增敏作用及机制。方法(1)MTT法测定药物对细胞的抑制作用,计算半数抑制浓度IC50。(2)应用集落形成法观察药物对细胞的放射增敏作用。(3)流式细胞仪分析药物对细胞周期分布、凋亡的影响。结果药物作用48小时后,细胞生长受到抑制,且细胞抑制率随药物浓度的升高而增加。IC50为16.04 mg/mL。加药照射组与单纯照射组比较,细胞存活率下降,药物有放射增敏作用,随药物作用时间的延长放射增敏作用增强。单纯照射组、加药24小时、48小时后照射组三组D0值依次为2.13 Gy、2.04 Gy、1.64 Gy,Dq值依次为2.88 Gy、1.68 Gy、1.51 Gy,加药24小时及48小时后照射组放射增敏比SERD0分别为1.04、1.3,SERDq分别为1.71、1.91。流式细胞仪检测药物作用后G2/M期细胞增加,细胞凋亡率升高,药物作用时间延长以上变化更显著。结论艾迪注射液对肺癌细胞A549有抑制作用及放射增敏作用,其放射增敏作用机制可能为抑制细胞亚致死损伤修复,阻滞细胞于G2/M期,诱导细胞凋亡。

大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析

利用RT-PCR、RACE和LAPCR相结合的方法,从大豆中克隆了GmAOS基因及其启动子序列(登录号为EU366252),GmAOS基因共1789bp碱基,等电点8.97,分子量58.3kD,在3种不同抗性大豆材料中均有2个拷贝。生物信息学分析表明,GmAOS酶的N末端有典型叶绿体定位信号肽,基因序列上有多个丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点。该研究克隆到ATG上游472个碱基的GmAOS基因启动子部分序列,其含有赤霉素的响应元件(TAACAA),可诱导性抗性基因响应元件(Wbox),细菌和盐诱导的响应元件(GAAAAA),茉莉酸诱导的响应元件(Gbox)。GmAOS能强烈响应茉莉酸的诱导,且在黄皮小青豆(高抗斜纹夜蛾)中表达量高于徐疃大豆,两种材料抗虫性的差异可能是由GmAOS基因受诱导后的表达量差异引起的,即GmAOS基因与作物抗虫性相关,可作为培育高诱导抗性材料的候选基因。

三氧化二砷对肝癌细胞侵袭转移的影响及机制

目的探讨三氧化二砷(As2O3)抗肝癌侵袭转移的机制。方法体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,将0、1.0、2.0μmol/L浓度的As2O3作用于SMMC-7721细胞,采用过河实验检测肿瘤细胞体外运动;MTT法观察细胞黏附能力;Transwell体外侵袭转移模型检测细胞迁徙、侵袭能力;并用PCR法检测乙酰肝素酶(HPA)mRNA表达。结果0、1.0、2.0μmol/LAs2O3作用SMMC-7721细胞后,表现为过河时间延长,细胞黏附抑制率明显上升,过膜细胞数减少(P<0.01),HPA基因表达量降低(P均<0.01);且呈剂量依赖性。结论As2O3可明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞黏附、迁徙和侵袭能力,下调HPA mRNA表达,此可能为其抗肿瘤侵袭转移作用的机制之一。

熊去氧胆酸对结肠癌细胞株Caco-2增殖及凋亡的影响

目的通过观察熊去氧胆酸(UDCA)对结肠癌细胞株Caco-2增殖和凋亡的影响,以探讨其对结直肠癌化学预防的机制。方法体外培养人结肠癌细胞株Caco-2,用不同浓度UDCA进行UDCA干预,检测其对细胞增殖、凋亡的作用。结果随着UDCA浓度增高和作用时间延长,细胞增殖抑制率升高,凋亡比率增大。结论UDCA能抑制人结肠癌细胞株Caco-2增殖,促进其凋亡。

蛋白激酶A催化微管相关蛋白tau磷酸化的研究

目的:研究蛋白激酶A(PKA)对微管相关蛋白tau的磷酸化作用。方法:采用免疫印迹技术,利用位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,检测PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性及磷酸化作用动力学。用双倒数作图,计算PKA催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞的实验,研究PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性。结果:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,而且各位点磷酸化作用的Km值不同,PKA对Ser214的Km值最低,即对Ser214位点的亲和性最高,催化其磷酸化的能力最强。在细胞实验中,也显示了PKA引起Ser214位点的磷酸化最明显。结论:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,其中Ser214是PKA催化tau磷酸化反应的最好位点。

应用基因表达数量性状基因座定位(eQTL)研究PINK1表达调控

Pink 1基因编码定位于线粒体上的丝/苏氨酸激酶(即PARK6),为常染色体隐性遗传性帕金森病(Parkinson's disease,PD)连锁的基因.该基因在遗传性和散发性PD的发病中起重要作用,但其发病机理尚未明确.本研究以近交系C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)小鼠制作MPTP诱导的PD鼠为模型,借助基因表达数量性状基因座(eQTL),结合分子生物学方法,分析Pink1的表达调控.结果显示,Pink 1基因在PD模型组中表达显著升高.区间连锁分析检测显示,引起Pink 1基因表达水平差异的染色体区域,定位于4号染色体上,距Pink 1基因自身5 Mb范围之类,属于顺式调节eQTL.Pearson相关分析表明,在BXD基因重组近交系(recombinant inbred,RI)小鼠脑中,Camk2n等30个基因的表达与Pink 1基因高度相关,相互间可能存在一定的协同作用.Pink 1基因在行使特定生物学功能时,很可能协同这些基因一起发挥相应的作用,这部分基因是深入研究Pink 1基因在PD发病中分子机制的重要靶点.

留学生生物化学与分子生物学教学体会与改革方法初探

随着中国教育水平的不断提高,越来越多的留学生选择到中国学习医学技术,生物化学既是医学留学生的必修课程之一,也是开展医学研究的基础学科,与诸多医学基础学科广泛联系,相互交叉,相互渗透。因此,生物化学与分子生物学的教学质量对留学生的全面发展非常重要。通过针对留学生生物化学与分子生物学的8年教学实践,根据留学生自身的特点和生物化学与分子生物学的课程特点,作者对该校留学生的生物化学与分子生物学理论教学从教和学2个方面进行了有益的探索,初步形成了一套针对留学生的理论教学体系,教学效果较为显著,增强了留学生的学习兴趣,提高了留学生的自主学习能力和分析解决问题的能力,同时培养了他们的创造力,拓宽了科研思维能力。该次教学改革和探索对以后该课程的留学生教育有所裨益。

PBL模式在血液系统疾病教学中的应用

在临床医学专业学生中开设血液科PBL课程,使学生能将理论知识联系血液临床实践,快速调动学习积极性,培养正确的血液科临床思维习惯,将血液学这门专科性极强的医学知识系统能有效地为学生接受。同时提高学生的医学人文修养,锻炼团队协作精神,藉此帮助学生提高专业素养、沟通技巧和社会责任感。

O-GlcNAc糖基化对转录因子CREB活性和心肌细胞形态的影响

目的:研究心肌缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化是否通过促进转录因子CAMP反应元件结合蛋白(CREB)的活性而引起心肌细胞形态变化。方法:在HEK-293T细胞内过表达调控O-GlcNAc糖基化的酶O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和O-连接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA),Western blot检测细胞内的O-GlcNAc糖基化水平和CREB的磷酸化。原代培养大鼠心肌细胞,药物DON和PUGNAc改变细胞内的O-GlcNAc糖基化水平,光镜下观察细胞形态,Western blot检测细胞内的O-GlcNAc糖基化水平和CREB的磷酸化。结果:在HEK-293T细胞和原代培养的大鼠心肌细胞中改变O-GlcNAc糖基化水平,CREB磷酸化也随之改变,两者呈正相关。升高原代大鼠心肌细胞内的O-GlcNAc糖基化水平,心肌细胞数目减少,形态增大。结论:O-GlcNAc糖基化调节CREB的活性,两者呈正相关。心肌缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化很可能通过促进CREB的活性而引起心肌细胞体积增大密度下降,可能是导致心肌重构的重要原因。

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的：克隆胞苷磷酸激酶（CMPK）基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌。方法：利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CMPK和pET28a（＋）表达载体,连接后,转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞,酶切鉴定。用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间（3、6h）后,取E.coli上清液做电泳分析。结果：所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6~0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显。结论：成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21（DE3）重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础。

硫胺素等缺乏与骨肉瘤病因的关系

在诊治营养不良和超重体力劳动者的临床实践中,发现营养不良可引起肿瘤。因而有针对性的对一些肿物(包括颌下腺囊肿和腋窝囊肿等)单独注射硫胺素(维生素B1)。发现疗效很好,本文对1例溶骨性骨肉瘤注射硫胺素,经围绕癌瘤一次注射硫胺素300 mg后,癌块急剧缩小50%以上。国际上对硫胺素是否致癌或治癌尚有争议,本文以临床实践为依据,提出硫胺素缺乏可能是骨肉癌的病因之一。

高脂饲料诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌己糖胺通路流量的变化

目的探讨己糖胺通路（HBP）在高脂饲料诱导胰岛素抵抗形成中的作用。方法雄性sD大鼠随机分为3组：对照组、高脂组和罗格列酮组。13周后，检测大鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）、骨骼肌中TG和FFA的含量，胰岛素敏感性采用胰岛素敏感指数（ISI）和高胰岛素正糖钳夹试验稳态时的葡萄糖输注率（GIR）来评估，骨骼肌HBP的流量用谷氨酰胺：6-磷酸果糖转氨酶（GFAT）mRNA的表达水平、二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡萄糖胺（UDP—GlcNAc）的含量及蛋白O—GlcNAc糖基化水平来衡量。结果高脂组大鼠与对照组相比，血清TG、TC、FFA以及骨骼肌TG、FFA均升高（均P〈0．01）；ISI、GIR均降低（均P〈0．01），骨骼肌GFATmRNA的表达（0．51±0．05对0．18±0．02）、UDP—GlcNAc含量[（6．18±0．86对2．42±0．36）nmol／g]以及蛋白O—GlcNAc糖基化水平均明显升高（均P〈0．01）。罗格列酮组大鼠与高脂组相比，血清和骨骼肌TG、FFA明显降低（均P〈0．01），胰岛素敏感性提高（P〈0．05），GFATmRNA的表达（0．27±0．03）、UDP—GlcNAc含量[（2．62±0．32）nmol／g]以及蛋白O—GlcNAc糖基化水平均明显降低（均P〈0．05）。结论高脂饲料诱导大鼠胰岛素抵抗与其增加骨骼肌HBP的流量相关，可被罗格列酮降低。