突触后密度蛋白-95在大鼠脊髓发育过程中的表达变化

目的:探讨突触后密度蛋白-95(PSD-95)在大鼠脊髓发育过程中的表达变化以及细胞定位。方法:采用实时定量PCR(Real-Time PCR)和Western blot测定发育不同时期PSD-95 mRNA及蛋白水平的表达变化。采用免疫荧光染色显示PSD-95在发育脊髓中的细胞定位。结果:大鼠脊髓发育过程中PSD-95 mRNA及其蛋白水平从生后1d开始逐渐升高,在生后1周达高锋,成年后维持在一定的生理水平。免疫荧光双标证实PSD-95在生后发育早期主要定位于脊髓灰质,与神经元的标记物NeuN和突触的标记物synapsin存在共定位;成年后广泛分布于脊髓前角、后角以及白质,分别与NeuN和synapsin以及小胶质细胞的标记物OX-42共定位。结论:大鼠脊髓发育过程中PSD-95在基因和蛋白水平呈现明显的时相变化,在生后发育早期主要表达在前角运动神经元和后角感觉神经元,提示PSD-95参与了神经元的发育和成熟。

cyclin D3与淋巴瘤细胞增殖相关性的初步研究

目的:初步探讨cyclin D3与淋巴瘤细胞增殖活性的相关性。方法:运用荧光免疫细胞化学法结合激光共聚焦显微镜观察,分析淋巴瘤细胞株Raji细胞内cyclinD3与Ki67表达、定位的关系。通过转染pDsRedcyclinD3和pSuPERcyclinD3siRNA质粒,分析改变cyclinD3表达水平对肿瘤细胞增殖能力的影响。结果:在分裂增殖旺盛的Raji细胞中,Ki67与cyclinD3共定位于细胞核内。导入外源性cyclinD3引起相应细胞核Ki67的表达增加,阻断内源性cyclinD3基因表达,导致同一细胞相同部位Ki67表达水平下降。结论:cyclinD3的表达水平与NHL细胞增殖活性密切相关,提示其可能在淋巴瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。

突触后密度蛋白95在大鼠脊髓损伤后的表达变化

目的:探讨突触后密度蛋白95(PSD-95)在脊髓损伤(SCI)后的表达变化以及定位情况。方法:使用改良Allen's法建立大鼠急性脊髓损伤模型。采用实时定量PCR和Western印迹法测定损伤后各时间段PSD-95 mRNA及其蛋白水平在脊髓中的表达变化。采用免疫荧光双标方法显示PSD-95在正常脊髓中的分布以及损伤后的定位改变。结果:PSD-95 mRNA及其蛋白水平在SCI后呈现逐渐下降的趋势,mRNA在5 d降到最低水平,蛋白水平在7 d最低。PSD-95与神经型一氧化氮合酶(nNOS)在SCI后8 h存在着共定位关系,但在SCI后7d,PSD-95除与nNOS部分共定位之外,还高表达于损伤局部活化中性粒细胞和巨噬细胞。结论:SCI后PSD-95在基因和蛋白水平呈现明显的时相变化,并且损伤后高表达在活化的炎症细胞,提示PSD-95参与了脊髓继发性损伤过程。

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的:制备NIDD基因TaqM an探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR(FQ-PCR),以进一步研究NIDD的表达情况。方法:采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区(CDS)片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度112 bp相符,DNA序列测序的结果与GeneBank提供的已知序列(AB098078)比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112 bp完全相同,与NIDD基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqM an探针。

突触后密度蛋白-95在大鼠坐骨神经损伤后的表达

为了探讨突触后密度蛋白-95(PSD-95)在周围神经损伤过程中的表达变化,本实验建立大鼠坐骨神经夹伤模型,采用荧光定量PCR(real-timePCR)和Western blotting对PSD-95 mRNA及其蛋白水平进行定量检测,应用免疫荧光双标技术观察PSD-95与神经型一氧化氮合酶(nNOS)的共定位情况。结果显示,PSD-95 mRNA及其蛋白在正常坐骨神经中度表达,损伤后迅速下降;PSD-95 mRNA从损伤后2d开始表达上调;而其蛋白水平于损伤后1周明显升高。免疫荧光双标染色证实在坐骨神经损伤后1周PSD-95与nNOS共定位于Schwann细胞上,而与神经丝蛋白NF-200共定位不明显。本研究结果提示PSD-95通过nNOS参与了周围神经损伤修复过程。

CDK11^(P58)和Cyclin D3在损伤后大鼠坐骨神经中的表达变化

为了探讨大鼠坐骨神经损伤对CDK11P58和Cyclin D3表达的影响,本实验将成年SD大鼠随机分为假手术组和夹伤组,运用Western blot结合免疫荧光组织化学双标技术,观察了坐骨神经损伤后坐骨神经夹伤段、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内CDK11P58和Cyclin D3的表达变化。结果显示:(1)坐骨神经夹伤后,坐骨神经夹伤段及脊髓腰膨大前角、伤侧腓肠肌中的CDK11P58蛋白的表达先逐渐下降,后又逐渐上升;而Cyclin D3的表达无明显变化;(2)在假手术组的坐骨神经、脊髓腰膨大前角和腓肠肌内都可观察到CDK11P58和Cyclin D3的表达;而坐骨神经夹伤后,在上述部位可检测到CDK11P58的表达强度明显减弱,但Cyclin D3无明显变化;(3)免疫荧光双标结果显示CDK11P58和Cyclin D3在假手术组的坐骨神经、脊髓腰膨大前角和伤侧腓肠肌内都有共存;而在坐骨神经损伤后这种共存强度明显降低。以上结果提示,坐骨神经损伤可影响坐骨神经及脊髓腰膨大、伤侧腓肠肌内CDK11P58的表达,但对Cyclin D3无明显影响,表明CDK11P58可能在周围神经损伤和修复中发挥重要作用。

SSeCKS对牛肺动脉内皮细胞黏附和迁移的影响

目的:研究SSeCKS在细胞外基质成份诱导内皮细胞黏附和迁移中的作用。方法:用纤黏连蛋白(FN)诱导内皮细胞,以Western blotting分析SSeCKS表达量的变化;用Ro31-8220、calphostin C(蛋白激酶C抑制剂)预处理内皮细胞,观察对细胞黏附和迁移的影响,以共聚焦显微镜观察其对SSeCKS、F-actin和vinculin在细胞定位的影响。结果:FN能够显著诱导内皮细胞黏附和迁移,SSeCKS的表达量也随之增加,具有时间和剂量依赖性;经Ro31-8220、calphostin C处理细胞后,SSeCKS表达量明显减少,细胞黏附率和迁移细胞数也较处理前显著减少,SSeCKS由细胞质散在分布向核周聚集,且SSeCKS与F-actin、vinculin在细胞边缘共定位比处理前减少。结论:SSeCKS参与细胞外基质诱导内皮细胞黏附和迁移的过程,由其介导的PKC信号转导促进了这一过程,蛋白激酶C抑制剂可有效抑制此过程。

突触后密度蛋白-93在大鼠脊髓损伤后的表达变化

目的探讨突触后密度蛋白-93(PSD-93)在脊髓损伤(SCI)后的表达变化以及定位情况。方法使用改良Allen法制备大鼠急性脊髓损伤模型,致大鼠脊髓(T9、T10)重度撞击伤。采用实时定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting测定损伤后各时间段PSD-93 mRNA及其蛋白水平在脊髓中的表达变化。采用免疫荧光双标方法检测PSD-93在正常脊髓中的分布以及损伤后的定位改变。结果PSD-93 mRNA水平在SCI后呈现逐渐下降的趋势,在3d降到最低水平;蛋白水平则在SCI后显著上调,于1d达高峰。免疫荧光双标显示,PSD-93在SCI后除与神经型一氧化氮合酶(nNOS)存在着共定位之外,还高表达于损伤局部活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。结论脊髓损伤后PSD-93在基因和蛋白水平呈现明显的时相变化,并且与nNOS、活化的胶质细胞存在共定位,提示PSD-93参与了脊髓继发性损伤过程。

实时荧光定量聚合酶链反应突触后密度蛋白93基因TaqMan探针的制备

目的:制备实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)突触后密度蛋白93(PSD93)基因TaqM an探针以进一步研究PSD93表达情况。方法:采用RT-PCR法,从生后1天的SD大鼠大脑组织mRNA中扩增PSD93基因部分CDS区片段,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定,采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度113bp相符,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列(RNU50717)比较,所克隆的PSD93基因片段与其中的113bp完全相同,与PSD93基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率为0.95,各点变异系数小于20%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功获得FQ-PCR PSD93基因TaqM an探针。

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ在CD4~ +T_H细胞中的表达及对其黏附能力的影响

目的研究β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferaseⅠ,β-1,4-GalTⅠ)在CD4^+TH中的表达与定化以及β-1,4-GalTⅠ对CD4^+TH细胞黏附能力的影响。方法采用免疫磁珠阳性分选法分离纯化CD4^+TH细胞,通过RT-PCR、荧光免疫细胞化学法和激光共聚焦技术鉴定CD4^+ TH细胞中β-1,4-GalTⅠ的表达与定位;分别用rhIL-2、rhIL-12、rhIL-4等细胞因子组合诱导CD4^+TH细胞活化分化,通过半定量RT-PCR、FCM检测CD4^+TH细胞中β-1,4-GalTⅠ的表达变化,运用层黏连蛋白结合实验比较CD4^+TH细胞黏附能力的改变;用α-乳清蛋白干扰CD4^+TH细胞表面β-1,4-GalTⅠ的活性及底物特异性,用层黏连蛋白结合实验分析其对CD4^+TH细胞黏附能力的影响。结果CD4^+TH细胞表面和细胞浆内表达长型和短型β-1,4-GalTⅠ;rhIL-2活化的CD4^+TH细胞长型β-1,4-GalTⅠmRNA水平及细胞膜表面β-1,4-GalTⅠ表达水平、细胞黏附能力均高于未经活化的CD4^+TH细胞, rhIL-2^+rhIL-12诱导培养的CD4^+TH细胞增强更明显;CD4^+TH细胞长型β-1,4-GalTⅠmRNA水平及细胞膜丧面β-1,4-GalTⅠ表达水平均与CD4^+TH细胞黏附能力呈正相关;α-浮清蛋白干扰后CD4^+TH细胞黏附能力降低。结论β-1,4-GalTⅠ在CD4^+TH细胞中表达,且与细胞黏附能力密切相关,提示β-1,4-GalTⅠ可能在CD4^+TH细胞的黏附过程中发挥重要作用。