载脂蛋白E和Ⅱ型髓系细胞受体在脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应中的作用

目的探讨载脂蛋白E(ApoE)、Ⅱ型髓系细胞受体(TREM2)在脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞炎症反应中的作用。方法原代培养野生型小鼠及基因敲除(ApoE-/-、TREM2-/-、ApoE-/-TREM2-/-)小鼠的小胶质细胞。用0 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml LPS刺激野生型小鼠小胶质细胞,用0 ng/ml、500 ng/ml LPS刺激ApoE-/-小鼠、TREM2-/-小鼠、ApoE-/-TREM2-/-小鼠小胶质细胞。采用RT-PCR及Western blotting法检测ApoE、TREM2 mRNA和蛋白水平;应用RT-PCR检测TNF-α、IL-1βmRNA水平。结果与0 ng/ml LPS组比较,100 ng/ml LPS组及500 ng/ml LPS组野生型小鼠小胶质细胞ApoE、TREM2 mRNA及蛋白水平均明显降低(均P<0.05)。与100 ng/ml LPS组比较,500 ng/ml LPS组野生型小鼠小胶质细胞ApoE、TREM2 mRNA及蛋白水平均明显降低(均P<0.05)。用500 ng/ml LPS刺激后,野生型、ApoE-/-、TREM2-/-、ApoE-/-TREM2-/-小鼠小胶质细胞的TNF-α、IL-1βmRNA水平明显升高(均P<0.05)。ApoE-/-、TREM2-/-、ApoE-/-TREM2-/-小鼠小胶质细胞的TNF-α、IL-1βmRNA水平显著高于野生型小鼠(均P<0.05)。结论 ApoE和TREM2能够协同抑制LPS诱导小胶质细胞的炎症反应,在调节CNS炎症中起着重要作用。这些基因可能与AD的发生密切相关。

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。

人BAFF-R基因启动子活性的初步研究

目的以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域。方法克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞,检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域。结果8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性最强,pGL3-B8启动子活性最低。结论BAFF-R基因5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域。

卵巢浆液性癌发病机制的研究新进展

卵巢癌是常见的女性生殖器官恶性肿瘤之一，全世界每年大约有二十万女性惠上卵巢癌。由于卵巢癌患者在患病早期症状不明显，而且缺乏特异性症状和有效实用的早期诊断手段，70％以上的患者确诊时已届晚期，治愈率非常低。尽管目前有许多关于卵巢癌的早期诊断的研究，但人们对卵巢癌的发病机制尚不清楚。基于此，本文对卵巢浆液性癌的组织病理类型、分子遗传学特点以及卵巢浆液性癌的发病机制与临床病理意义进行研究并作综述，以期对卵巢浆液性癌的检查与治疗做出自己的贡献。

瘦素特异性小干扰RNA对实验性肝纤维化的影响

目的 研究针对大鼠瘦素基因的小干扰（si）RNA对肝纤维化的治疗效果.方法 将40只雄性SD大鼠平均分为4组,正常对照组皮下注射橄榄油溶液3 ml/kg,2次/周,共6周;肝纤维化模型组皮下注射60% CCl4 3 ml/kg,2次/周,共6周;siRNA治疗组和阴性对照组均于皮下注射60% CCl4 3 ml/kg,2周后尾静脉分别注射siRNA或阴性对照质粒0.2 mg/kg.每周测体质量1次,根据体质量调整药物用量.设计针对瘦素mRNA的siRNA,并构建其表达载体;用脂质体方法通过尾静脉注射转染入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,然后分别采用逆转录-聚合酶链反应、免疫组织化学方法检测瘦素与Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏组织中的表达.免疫组织化学资料采用等级资料秩和检验.PCR结果采用单因素方差分析进行统计学处理,P＜0.05时用SNK法进行多重比较.结果 瘦素mRNA在正常对照组组、肝纤维化模型组、siRNA治疗组和阴性对照组的相对表达量分别为0.75±0.03、2.34±0.14、0.90±0.06、2.31±0.13,各组比较,F=797.64,P=0.000,差异有统计学意义;Ⅰ型胶原mRNA在各组的相对表达量分别为1.10±0.11、2.75±0.13、1.27±0.08、2.77±0.12,各组比较,F=695.71,P=0.000,差异有统计学意义;Ⅲ型胶原mRNA在各组的相对表达量分别为0.62±0.07、1.52±0.09、0.85±0.08、1.51±0.07,各组比较,F=371.57,P=0.000,差异有统计学意义.结论 针对瘦素基因的siRNA对肝纤维化有明显的治疗作用.

5-氮杂脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞的生长及RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂——5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza—CdR）对子宫内膜癌细胞的生长及RASSF1A基因表达的影响。方法5-Aza—CdR作用后，采用锥虫蓝染色法、流式细胞仪分别检测子宫内膜癌细胞株HEC一1B细胞的生长及凋亡情况，采用RT—PCR技术、甲基化特异性PCR（MSP）技术分别检测HEC-1B细胞中RASSF1A mRNA的表达和RASSF1A基因启动子的甲基化状态。结果（1）HEC-1B细胞的生长及凋亡情况：5-Aza—CdR对HEC-1B细胞生长的抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性（P〈0．01）；且HEC-1B细胞的凋亡率也呈明显的剂量依赖性（P〈0．01）。（2）HEC-1B细胞中RASSF1A mRNA的表达：未经5-Aza—CdR作用的HEC-1B细胞中RASSF1A mRNA表达缺失；不同浓度5-Aza—CdR（分别为0．05、0．1、1、5、10nmol／m1）作用后，HEC-1B细胞中RASSF1A mRNA表达不同程度地上升，其相对表达水平分别为0．074±0．004、0．105±0．004、0．1674-0．006、0．3344-0．005、0．484±0．007，分别与未经5-Aza—CdR作用的细胞（为0）比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（3）HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子的甲基化状态：未经5-Aza—CdR作用的HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子呈高甲基化状态；加入低浓度（即0．05、0．1、1、5nmol／m1）的5-Aza—CdR后，HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子的甲基化水平下降，呈半甲基化状态（即同时出现甲基化和非甲基化条带）；当5-Aza—CdR浓度为10nmol／ml时，HEC一1B细胞中RASSFlA基因启动子呈非甲基化状态。结论（1）-Aza—CdR可抑制HEC-1B细胞增殖、促进HEC-1B细胞凋亡。（2）5-Aza—CdR能使HEC-1B细胞重新表达RASSF1A mRNA，能逆转RASSF1A基因启动子的高甲基化状态。