雌激素相关受体α介导的脂噬对鼻咽癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨雌激素相关受体α(ESRRA)介导的脂噬对鼻咽癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法选取2021年至2023年南通大学附属医院经病理确诊的临床样本16例,其中正常鼻咽黏膜8例,鼻咽癌8例;选择永生化的正常鼻咽上皮细胞株NP69和鼻咽癌细胞C666-1、CNE2、TW03-EBV、TW03。将鼻咽癌C666-1、CNE2细胞株分别分为siR-NC组(转染小干扰RNA阴性对照序列)和siR-ESRRA组(转染针对ESRRA基因的小干扰RNA)。采用蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测ESRRA蛋白相对表达水平;EdU实验检测C666-1、CNE2细胞增殖能力;Transwell实验检测C666-1、CNE2细胞迁移能力;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ESRRA、围脂滴蛋白3(PLIN3)mRNA的相对表达水平;透射电镜观察C666-1、CNE2细胞脂噬的形成;使用氟硼荧染料(Bodipy)标记脂滴后,通过细胞免疫荧光实验观察脂滴与LC3、PLIN3、LAMP2的共定位情况;双荧光素酶报告基因实验验证ESRRA与PLIN3的靶向关系。结果鼻咽癌组织中ESRRA蛋白相对表达量(1.15±0.75)高于正常鼻咽黏膜组织(0.32±0.21),差异有统计学意义(t=3.02,P=0.009)。鼻咽癌细胞株C666-1、CNE2、TW03-EBV、TW03中ESRRA蛋白相对表达量分别为1.539±0.044、1.420±0.030、2.867±0.044、1.323±0.022,均高于正常鼻咽上皮细胞NP69(0.094±0.002),差异有统计学意义(F=34.08,P<0.001)。EdU实验结果显示,siR-NC组和siR-ESRRA组CNE2细胞中EdU标记阳性细胞比例分别为(70.44±4.06)%和(51.51±0.92)%(t=7.88,P=0.001),C666-1细胞中分别为(62.25±3.89)%和(54.91±0.27)%(t=3.26,P=0.031)。Transwell实验结果显示,CNE2、C666-1细胞中siR-ESRRA组迁移细胞数均少于siR-NC组[CNE2细胞:(181±7)个比(261±21)个;C666-1细胞:(201±16)个比(256±7)个],差异均有统计学意义(t=6.30,P=0.003;t=5.43,P=0.006)。qRT-PCR检测结果显示,siR-ESRRA组PLIN3 mRNA相对表达量较siR-NC组高(CNE2细胞:1.58±0.16比0.83±0.17,t=5.59,P=0.005;C666-1细胞:1.37±0.12比1.06±0.06,t=3.86,P=0.018)。双荧光素酶报告基因实验结果显示ESRRA与PLIN3有靶向结合关系。透射电镜观察敲低ESRRA后细胞中脂滴含量增加,与自噬小体结合减少;免疫荧光实验结果显示,与siR-NC组比较,siR-ESRRA组LC3和LAMP2与脂滴的共定位减少、PLIN3与脂滴的共定位增加。结论ESRRA在鼻咽癌组织和细胞中高表达,作为转录抑制子抑制PLIN3转录,降低脂滴稳定性,介导脂噬,促进鼻咽癌增殖、迁移。

细胞外囊泡在慢性鼻窦炎和变应性鼻炎中的研究进展

细胞外囊泡是几乎所有细胞均能向外分泌的具有膜结构的纳米级囊泡,在细胞间信号通信中起重要作用。细胞外囊泡包括外泌体、微泡及凋亡小体,能够将蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质转运至靶细胞,参与机体生理状态的维持及多种疾病的发生、发展。本综述主要介绍细胞外囊泡在慢性鼻窦炎和变应性鼻炎中的研究进展,以期为这2种疾病的发病机制及潜在治疗靶点的研究提供新思路。

自噬通过诱导休眠多倍体巨大肿瘤细胞形成促进鼻咽癌复发的研究

目的探究休眠的多倍体巨大肿瘤细胞(polyploid giant cancer cells,PGCC)对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)复发的影响,明确抑制自噬在阻止NPC复发中的作用。方法利用紫杉醇(paclitaxel,PTX)诱导NPC细胞来源的PGCC(NPC-PGCC)形成,并利用光学显微镜、细胞免疫荧光、活/死细胞双染色实验对PGCC形态、多倍体特性、细胞活性等进行鉴定。采用转录组测序(RNA-seq)检测NPC-PGCC和二倍体NPC细胞CNE2的差异表达基因。采用基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对差异基因进行功能富集和通路注释分析。利用免疫蛋白印迹与细胞透射电镜实验评估NPC-PGCC细胞中的自噬水平。利用临床高度相关的裸鼠NPC复发模型研究自噬在NPC-PGCC形成中的作用及NPC-PGCC对NPC复发的影响。所有数据采用GraphPad Prism 6进行统计学分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果紫杉醇诱导形成的NPC-PGCC具有休眠后爆炸性分裂的特征。NPC-PGCC和二倍体NPC细胞CNE2的差异基因GO富集、KEGG通路注释主要集中在自噬及其相关通路。NPC-PGCC细胞中的自噬水平显著增强。临床高度相关裸鼠NPC复发模型中,进行顺铂治疗的裸鼠原发肿瘤中PGCC数量高于其余各组;自噬抑制剂预处理后与顺铂联合治疗的裸鼠原发肿瘤中PGCC数量少,同时复发率显著低于其余各组。结论休眠多倍体巨大肿瘤细胞的形成机制与自噬有关,抑制自噬可通过抑制PGCC形成进而抑制NPC复发。

RUNX1在鼻息肉黏膜上皮细胞凋亡中的作用研究

目的探究Runt相关转录因子1(Runt-related transcription factor 1,RUNX1)在鼻息肉(nasal polyps,NPs)组织中的表达差异,并分析RUNX1在NPs原代人鼻黏膜上皮细胞(primary human nasal epithelial cells,pHNECs)凋亡中的作用及调控机制。方法以免疫蛋白印迹(WB)和免疫组织化学染色检测组织层面RUNX1的表达水平。采用肿瘤坏死因子α(TNF-α,20 ng/ml)体外诱导pHNECs发生凋亡,进行Hoechst染核观察细胞凋亡。随后,通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和WB检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤基因2(B-cell lymphoma-2,BCL-2);BCL2相关蛋白质X(BCL2-associated X,BAX);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的表达,评估凋亡水平。将sh-RUNX1-6质粒转染至pHNECs凋亡模型,用WB和流式细胞术评估RUNX1沉默对凋亡的影响。通过SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果NPs组织中RUNX1的表达明显高于正常下鼻甲组织,差异具有统计学意义(0.274±0.042比0.110±0.027,t=9.675,P<0.05)。与下鼻甲组织相比,NPs中BAX和Caspase-3高表达,而BCL-2低表达,差异具有统计学意义(BAX 0.346±0.032比0.302±0.037,Caspase-30.228±0.061比0.158±0.065,BCL-20.090±0.047比0.276±0.057,t值分别为2.680、2.361、7.575,P值均<0.05)。TNF-α诱导后pHNECs中RUNX1的蛋白、mRNA表达和凋亡水平均呈时间依赖性升高,差异具有统计学意义(P值均<0.05)。sh-RUNX1-6质粒转染能够下调TNF-α刺激下pHNECs中RUNX1的表达。沉默TNF-α刺激下pHNECs中的RUNX1后,细胞中BAX和Caspase-3的蛋白水平降低,而BCL-2表达增高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P值均<0.05)。结论RUNX1在NPs组织中高表达,沉默RUNX1能够抑制TNF-α诱导的pHNECs凋亡,从而减轻细胞炎症损伤。

鼻咽癌外泌体来源的长链非编码RNA结肠癌相关转录本2促进血管生成的实验研究

目的探究鼻咽癌来源外泌体中含有的长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录本(CCAT2)对鼻咽癌血管生成的影响。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为鼻咽癌细胞(CNE2)上清共培组与正常鼻咽上皮细胞(NP69)上清共培组,CCK8法检测两组HUVEC增殖能力。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CNE2上清与HUVEC共培后lncRNA CCAT2的表达。将HUVEC分为鼻咽癌患者血清共培组、健康人血清共培组,CCK8法检测两组HUVEC增殖能力,qRT-PCR检测两组HUVEC中lncRNA CCAT2的表达。超速离心法提取CNE2、NP69细胞上清外泌体。将HUVEC分为CNE2上清外泌体共培组与NP69细胞上清外泌体共培组,CCK8等血管生成实验比较两组HUVEC功能差异。在HUVEC中转染短发夹RNA(shRNA)抑制lncRNA CCAT2表达,CCK8等血管生成实验比较不同表达lncRNA CCAT2的HUVEC功能差异。通过shRNA转染CNE2,提取上清外泌体RNA,qRT-PCR检测不同表达lncRNA CCAT2的CNE2上清外泌体中lncRNA CCAT2的差异,将上述两组外泌体分别与HUVEC共培,qRT-PCR检测共培后HUVEC中lncRNA CCAT2的表达差异,同时迁移实验检测HUVEC的功能差异。用GraphPad Prism 8作图及统计分析。结果与NP69上清共培组相比,CNE2上清共培组HUVEC增殖能力较高。CNE2上清与HUVEC共培48 h与0 h相比,lncRNA CCAT2表达较高(1比1.40±0.01,t=42.43,P=0.000)。与健康人血清共培组相比,鼻咽癌患者血清共培组HUVEC增殖能力较高,48 h lncRNA CCAT2表达较高(1比1.25±0.03,t=14.43,P=0.001)。与NP69细胞上清外泌体共培组相比,CNE2上清外泌体共培组HUVEC增殖能力较高,迁移实验中穿过小室的细胞数较多(53.12±2.13比154.74±4.17,t=37.73,P=0.000),小管生成实验中结点数较多(10.72±1.02比53.65±3.21,t=22.63,P=0.000)。与sh-NC组相比,sh-CCAT2组HUVEC增殖能力较低,迁移实验中穿过小室的细胞数较少(401.34±22.15比138.25±6.85,t=23.19,P=0.000),裸鼠皮下基质胶栓塞实验中微血管计数较少(41.00±0.32比27.15±0.23,t=61.53,P=0.000)。与正常表达lncRNA CCAT2的CNE2上清外泌体(sh-NC外泌体组)相比,低表达lncRNA CCAT2的CNE2上清外泌体(sh-CCAT2外泌体组)中lncRNA CCAT2表达较少(1比0.65±0.02,t=30.31,P=0.000)。与sh-NC外泌体组相比,sh-CCAT2外泌体组HUVEC中lncRNA CCAT2的表达较低(1比0.73±0.01,t=46.77,P=0.000),sh-CCAT2外泌体组迁移实验中穿过小室的细胞数较少(389.73±26.34比190.54±8.36,t=12.47,P=0.001)。结论鼻咽癌来源外泌体中含有的lncRNA CCAT2促进鼻咽癌血管生成。

沉默信息调节因子1促进鼻咽癌增殖、迁移和脂质代谢机制的研究

目的分析沉默信息调节因子1(silent information regulator transcript-1,SIRT1)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织和细胞中的表达差异,探讨SIRT1对NPC细胞增殖和迁移的影响,研究SIRT1对NPC细胞脂质代谢的影响及调控机制。方法实验对象:组织标本来源于2019—2020年间就诊于南通大学附属医院耳鼻咽喉科并进行鼻咽部组织活检的患者,其中男6例,女6例,年龄27~72岁;其中经病理确诊的鼻咽癌7例,正常鼻咽部黏膜5例。另NPC细胞系CNE1、CNE2、5-8F和6-10B以及永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69为中南大学湘雅医院和中山大学肿瘤防治中心赠送。实验方法和观察指标:采用免疫蛋白印迹法(Western Blot)和实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测鼻咽癌组织和正常鼻咽部黏膜组织中SIRT1蛋白和mRNA水平。后续实验选取CNE2为实验的主要细胞,通过CCK8试剂盒检测细胞活力,利用划痕实验和Transwell系统检测细胞迁移能力。采用裸鼠异体肿瘤模型研究SIRT1抑制剂Ex527对体内肿瘤生长的影响。通过油红和氟化硼二吡咯(Bodipy)染料标记细胞内脂滴。在机制研究方面,利用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分析SIRT1与缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的相互作用。所有数据采用SPSS 26.0软件进行统计分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果NPC组织中SIRT1蛋白(1.005±0.168)和mRNA(5.829±2.395)水平均高于正常鼻咽黏膜组织(0.181±0.042、1.995±1.605),差异有统计学意义(t值分别为6.438、2.759,P值均<0.05)。NPC细胞系CNE1、CNE2、5-8F和6-10B中SIRT1的mRNA和蛋白水平也高于永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69。SIRT1的过表达促进了NPC细胞的增殖和迁移能力。注射Ex527组的裸鼠成瘤能力低于对照组。SIRT1的低表达降低了NPC细胞脂质合成关键酶的蛋白表达水平,提高了脂质分解酶的蛋白表达水平,HIF-1α过表达促进了NPC细胞脂质合成酶的蛋白表达。SIRT1通过增强HIF-1α的去乙酰化水平抑制HIF-1α转录。HIF-1α与SIRT1启动子区域的结合能力在NPC细胞缺氧时下降。结论SIRT1促进NPC的增殖、迁移和脂质代谢,有望为预后判断和基因治疗提供新的参考。