聚合酶链反应快速诊断棘阿米巴角膜炎的研究

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)技术快速诊断棘阿米巴角膜炎的价值。方法:建立棘阿米巴标准虫株的PCR检测方法,并应用于临床检测24例角膜刮片标本,结果与原虫培养及100g/L氢氧化钾湿封片镜检做比较。结果:PCR5h可检测出标本中微量棘阿米巴原虫,对照细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒、正常人角膜均为阴性。临床标本PCR敏感性为46%,明显高于原虫培养与100g/L氢氧化钾湿封片镜检(P<0.05)。结论:PCR速度快、敏感性和特异性高,有助于棘阿米巴角膜炎的快速明确诊断。

B淋巴细胞激活因子及其受体mRNA与系统性红斑狼疮关联性研究

目的:研究建立实时荧光定量(RFQ)-PCR法测定B淋巴细胞激活因子(BLyS)及其受体mRNA含量的方法,探讨其在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单一核细胞(PBMC)中表达的检测价值。方法:在BLyS及其受体基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,用反转录(RT)-PCR扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,用所建立的RFQ-PCR方法检测23例SLE患者、23名正常人外周血BLyS及其受体mRNA表达。结果:SLE患者B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B淋巴细胞活化因子受体(BAFF)-RmRNA的表达明显高于正常人(P<0.01),活动期患者的表达高于缓解期(P<0.01),抗ds-DNA抗体阳性和尿蛋白阳性的SLE患者BCMA、TACI和BAFF-RmRNA的表达高于阴性患者(P<0.01)。结论:RFQ-PCR检测BLyS及其受体mRNA含量的方法具有较好的灵敏度和重复性;SLE患者BLyS、TACI和BAFF-RmRNA表达含量升高,提示BLyS、TACI和BAFF-R可能与SLE的发病有关。

实时荧光定量酶联免疫吸附试验检测HBV-DNA的临床意义

目的:探讨实时荧光定量PCR检测HBV- DNA在乙型肝炎的诊断、治疗及判断病情、预防等方面的临床应用价值。方法:运用实时荧光定量PCR和EL ISA法同时检测了乙型肝炎180例和正常献血员5 6例血清中HBV - DNA的含量及其免疫标志物,并对结果进行对比分析。结果:乙肝大三阳95例HBV - DNA阳性达95例(10 0 .0 0 % ) ,显著高于其它各组(P<0 .0 5 ) ,HBV- DNA含量为4 .8×10 7copies·ml- 1 ;小三阳患者HBV- DNA阳性率低于大三阳组(P<0 .0 5 ) ,但平均病毒含量与大三阳组差异无显著性(P>0 .0 5 ) ,高达2 .1×10 7copies·ml- 1 ;单独HBs Ag阳性和单独HBs Ab阳性组HBV- DNA阳性率分别为5 3.85 %、33.33% ,平均病毒含量分别为5 .6×10 5copies·ml- 1、3.8×10 4 copies·ml- 1 ;献血员5 6例血清HBV- DNA阳性3例,其病毒含量低于其它组。结论:实时荧光定量PCR检测HBV- DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,这对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。

结直肠癌细胞株增殖诱导配体基因的克隆、表达及生物学活性分析

目的克隆结直肠癌细胞株增殖诱导配体(APRIL)基因,并测定APRIL胞外可溶性片段(sAPRIL)重组蛋白的生物学活性。方法采用RT-PCR技术,从肿瘤细胞株总RNA扩增APRIL全长及其胞外可溶性片段(sAPRIL)编码基因,PCR产物直接克隆于pGEM-T载体。将sAPRIL亚克隆到原核表达载体pET101/D-TOPOR○中,阳性克隆经IPTG诱导,SDS-PAGE分析sAPRIL的表达,对表达的蛋白初步纯化后进行生物学活性检测。结果 RT-PCR扩增出一个753bpDNA片段,酶切和测序证实该片段为编码人sAPRIL的全长cDNA,将sAPRIL克隆到表达载体经诱导后发现在20kDa处多显示出一条条带,纯化蛋白进行初步活性测定显示其可以剂量依赖方式促进细胞的生长。结论成功克隆了APRIL基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌进行了表达。纯化的重组蛋白可促进细胞生长,为进一步进行April基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。

南通地区630例外周血15个遗传性耳聋基因突变位点筛查分析

目的:通过对遗传性耳聋基因高频突变位点进行筛查分析,为南通地区遗传性耳聋的防治提供参考。方法:采集产科门诊孕妇606例以及因耳聋、听力障碍于耳鼻喉科门诊就诊患者24例共630例血液样本,采用微阵列基因芯片法进行遗传性耳聋常见的4个基因15个位点的检测。结果:630例样本中显示耳聋基因突变者为48例,突变率为7.62%,其中两个不同基因同时发生突变1例,以及同一个基因两个位点同时发生突变1例。包括GJB 2基因突变率为3.33%,其中杂合突变19例、纯合突变2例;SLC26A4基因突变率为3.02%,其中杂合突变18例、纯合突变1例;线粒体12S rRNA基因均质或异质突变5例(突变率为0.79%);GJB3基因杂合突变1例(携带率为0.16%)。孕妇样本阳性率为5.78%,耳鼻喉科患者样本阳性率为54.2%。结论:遗传性耳聋基因筛查可以有效筛查出听力正常人群中的携带者,指导其婚育。在听力损失人群中进行筛查,可以明确一部分病因,为患者及其家族成员提供遗传咨询和指导。

南通地区235例新生儿9个遗传性耳聋基因突变位点筛查分析

目的 :探讨本地区新生儿遗传性耳聋基因单基因单杂合突变发生率。方法:采集235例新生儿足跟末梢血血斑提取DNA,用微阵列芯片法检测常见的4个耳聋相关基因的9个突变位点。结果:235例血样中显示耳聋基因单基因单杂合突变为13例,携带率为5.53%,其中GJB 2基因杂合突变9例,携带率为3.83%,SLC26A4基因杂合突变4例,携带率为1.7%。结论:在新生儿中开展耳聋基因筛查非常有意义,对耳聋的早期诊断和预防具有重大意义,对携带者未来的婚配和生育有重要的指导作用。在健康人群中开展耳聋基因筛查,有助于防止遗传性耳聋患儿的出生,降低出生缺陷。

增殖诱导配体及其受体在肿瘤组织中的表达与意义

目的分析增殖诱导配体(APRIL)及其受体在不同肿瘤组织及肿瘤发展不同阶段的表达水平,探讨其与肿瘤发生的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测了临床上常见肿瘤组织中APRIL及其受体mRNA的准确含量,并以靶基因和内参mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果肿瘤组织中APRIL表达水平显著高于交界组织(P<0.05)和正常组织(P<0.05);B细胞成熟抗原(BCMA)和穿膜蛋白活化物(TACI)表达水平在大多数肿瘤组织中与正常组织差异无统计学意义(P>0.05);APRIL在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中表达水平显著高于正常黏膜(P<0.05),APRIL在胃癌组织中表达水平显著高于肠上皮化生和异型增生(P<0.05),而其受体BCMA和TACI在各组胃黏膜病变之间表达水平无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;APRIL在肿瘤发生、发展过程中可能起了重要作用;除了BCMA和TACI外,肿瘤细胞可能还存在APRIL未知受体;APRIL在某些类型肿瘤有可能主要是通过受体BCMA而不是TACI发挥作用。

实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

系统性红斑狼疮患者B细胞激活因子mRNA定量测定及其意义

目的建立实时荧光定量PCR(RFQ PCR)检测人B细胞激活因子(BLyS)mRNA含量的方法,初步探讨BLyS表达水平与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性。方法在BLyS基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,RT PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BLySmRNA含量,并以BLySmRNA和内参β2M mRNA含量的比值作为评价BLyS表达水平的指标。结果本法检测BLySmRNA含量的线性范围为109pg/ml～101pg/ml,批内和批间变异系数(CV)分别为2.4%～7.4%和4.3%～12.3%。SLE患者BLySmRNA表达水平(1.45±0.33)显著高于健康献血员(0.88±0.13),P<0.01,而且与血清IgG水平和抗ds DNA抗体滴度有显著相关性。结论建立RFQ PCR检测BLySmRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;BLyS在SLE的发生、发展及预后等方面可能具有重要作用。

APRIL及其受体在结直肠癌变过程中表达水平的改变

目的探讨APRIL及其受体表达水平在结直肠癌变过程中的作用。方法采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)技术检测结直癌发生各阶段组织中APRIL及其受体mRNA水平,并以靶基因和内参β_2-M mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果 APRIL在中、重度异型增生肠组织及原位癌、浸润癌组织中表达水平显著高于正常肠黏膜(P＜0．05),APRIL在癌组织中表达水平显著高于中、重度异型增生肠组织(P＜0．05),而其受体BCMA和TACI在结直肠癌发生各阶段的表达水平无统计学意义(P＞0．05)。结论 APRIL在结直肠癌的病变演进过程中呈现累积和渐进趋势,可能在结直肠癌发生、发展过程中起了重要作用,有可能成为结直肠癌早期诊断和抗癌治疗的靶分子。

RNA荧光定量标准品制备新方法的探讨

目的以丙型肝炎病毒(HCV)为例,介绍一种简便快速的RNA定量标准品的制备方法。方法RT-PCR扩增目的片段,产物以pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH 5α,经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品。结果RNA标准品具有较大的线性范围(109cop ies/m l^10 cop ies/m l),批内和批间重复性也较好,CV分别为1.68%~5.97%和6.40%~10.58%。结论此法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用。

人B细胞激活因子受体-TACI基因表达水平的定量测定

目的:建立实时荧光定量PCR(RFQPCR)检测人B细胞激活因子受体TACImRNA含量的方法,初步探讨健康献血员外周血单个核细胞(PBMC)中TACImRNA表达水平。方法:在TACI基因高保守区设计特异性的引物和荧光探针,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中TACImRNA准确含量,并以TACImRNA和β2MmRNA含量的比值作为评价TACI表达水平的指标。结果:本法检测TACImRNA含量的线性范围为109～101pg/ml,批内和批间重复性测定的CV分别为2.97%～9.32%和5.86%～10.29%。40例健康献血员样本的PBMC中35例(87.5%)检出有TACImRNA表达,范围为0.02～2.11。结论:成功建立RFQPCR检测TACImRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性,为进一步探讨TACImRNA表达水平与自身免疫性疾病发病机制之间的关系奠定了基础。

乙型肝炎病毒核酸的实时荧光定量PCR检测及其临床意义

目的建立实时荧光定量PCR(rea l-tim e fluorescence quan titative PCR,RFQ-PCR)检测HBV-DNA含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值。方法在HBV S基因高保守区设计了特异性的引物和探针,利用T aqM an探针的基本原理,PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本中HBV-DNA的准确含量。结果220例临床样本的检测结果显示,乙肝大三阳患者HBV-DNA阳性率(98.8%)显著高于其它各组(P<0.01),病毒平均含量为7.52±0.43 cop ies/m l;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0.01),但平均病毒含量与大三阳组无差异(P>0.05),高达7.41±0.26 cop ies/m l;单独HB sA g阳性和单独HB sA b阳性组HBV-DNA阳性率分别为56.4%,19.2%,平均病毒含量分别为5.35±0.32 cop ies/m l,4.02±0.31 cop ies/m l;80例献血员血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其它各组。结论RFQ-PCR检测HBV-DNA含量比EL ISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,对临床上抗病毒药物的选择和判断疾病的预后意义重大。

SYBR greenⅠ结合熔解曲线分析快速检测GSTM1基因多态性

目的建立一种快速检测人类谷胱甘肽S转移酶(GST)基因多态性的方法并初步应用。方法反应体系中加入新型荧光染料SYBR greenⅠ,应用多重PCR同时扩增GSTM1基因及内参照CYP1A1基因。PCR反应结束后,以0.1℃/s的速度从65℃到95℃检测并记录反应管荧光的变化,根据得到的熔解曲线分析GSTM1基因型。结果GSTM1基因携带型(GSTM1+)熔解曲线出现两个峰带,GSTM1基因空白型(GSTM1-)只出现一个峰带,两峰峰尖所对应的温度值与预期值相同,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量与预期分子量一致。DNA抽提后整个检测在L ightCyc ler扩增仪上1 h内完成。结论SYBR greenⅠ结合熔解曲线分析是一种简单、快速、准确的分析GSTM1基因多态性的方法。

胱抑素C检测在儿童肾小球疾病诊断中的意义

目的:探讨胱抑素C(CYS-C)在小儿肾小球疾病诊断中的意义。方法:用HITACHI7600-020生化分析仪检测53例小儿肾小球疾病患者血清中BUN、CRE、UA、TCh、CYS-C﹑β2MG。结果:肾小球疾病组的CYS-C、CRE等浓度明显高于对照组(P<0.01)。结论:CYS-C是反映小儿肾小球滤过率的重要指标,在小儿肾小球疾病诊断中有重要作用。

人乳腺癌组织中增殖诱导配体及受体mRNA水平定量测定

目的：分析乳腺癌组织中增殖诱导配体（APRIL）及其受体mRNA的表达水平.方法：采用实时荧光定量PCR（RFQ-PCR）技术检测临床样本中靶基因mRNA准确含量,并以靶基因和内参β2M mRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标.结果：RFQ-PCR检测靶基因mRNA含量的线性范围为10^9～10^1pg/ml,批内和批间重复性测定的变异系数v分别为3.87%～10.12%和6.86%～12.29%.乳腺癌25例组织样本的检测结果显示乳腺癌及癌旁组织中APRIL的水平均显著高于远端正常组织（P＜0.05）,而β细胞成熟抗原和穿膜蛋白活化物的表达水平在3组间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：成功建立RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;发现APRIL在乳腺癌组织中高表达,提示APRIL在乳腺癌发生、发展过程中可能起了重要作用.

PCR-RFLP分析HBV核心启动子基因突变的临床意义

目的建立聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测HBV核心启动子(BCP)基因突变的方法,并探讨其临床意义。方法PCR扩增HBVBCP区(nt1642-nt2027)基因片段,经限制性内切酶Mb0Ⅰ酶切,琼脂糖凝胶电泳分析BCP(nt1762／nt1764)基因突变情况,同时应用定量PCR测定了HBVDNA含量。结果149例临床样本的检测结果显示:BCP基因突变在HBeAb(+)慢性乙型肝炎患者(CHB)和HBV无症状携带者(ASC)中的检出率显著高于相应的HBeAg(+)组患者(P<0.01);在HBeAb(+)和HBeAg(+)重症乙型肝炎(SeverehepatitisB,SHB)组中差异无显著性(P>0.05);BCP变异患者血清中HBV-DNA含量比相同模式的野毒株感染高(P<0.05)。结论PCR-RFLP检测HBVBCP基因突变方法简单方便,结果与测序分析一致,具有较好的特异性,适合临床应用;BCP区基因突变可能是HBeAb(+)患者HBV感染的重要原因之一;BCP变异可能与乙型肝炎重症化有一定关系。

人肝癌组织中APRIL及其受体mRNA水平的定量测定

[摘要]目的：采用实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ—PCR）技术分析肝癌组织中增殖诱导配体（APRIL）及其受体mRNA的表达水平。方法：在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针，实时检测PCR产物的荧光强度。根据标准品建立的标准曲线。由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA准确含量，并以靶基因和内参B2MmRNA含量的比值作为评价靶基因表达水平的指标。

人B细胞激活因子受体-BAFF-R基因mRNA实时荧光定量PCR标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(RFQ,-PCR的标准品以定量检测人B细胞激活因子受体。BAFF-R基因mRNA的表达。方法在BAFF-R基因高保守区设计了特异性的引物和荧光探针,用RT-PCR法从人外周血单个核细胞的总mR-NA中逆转录扩增BAJFF-R的cDNA,将纯化的BAFF-R cDNA与PGEM-T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后提取重组质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I进行酶切鉴定并测序分析,最后对质粒标推进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原被的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实TNF-αcDNAn重组到PGEM-T载体上。结论成功克隆了BAFF-R实时荧光PCR定量标准。

丙型肝炎病毒核酸的荧光定量检测及其临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV-RNA含量方法的临床应用价值。方法:在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,PCR扩增目的片段并构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的巢式RT-PCR进行定性分析。结果:138例样本在HCV抗体阳性患者中,肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(P<0.05),而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.91)。结论:RFQ-RT-PCR检测HCV-RNA含量比ELISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HCV在体内的复制情况。