支气管哮喘患者外周血循环Tfh及Th9细胞的变化及临床意义

本研究旨在探讨循环滤泡辅助性T细胞(cTfh)及T辅助细胞9(Th9)在支气管哮喘患者中的变化及其可能的免疫学发病机制。选取25例急性发作期、20例缓解期哮喘患者及20例性别和年龄相匹配的健康对照作为研究对象,进行肺功能检查。流式细胞术检测外周血中cTfh及Th9细胞的百分率,real-time PCR检测转录因子Bcl-6和PU.1mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中总IgE水平。结果显示:急性发作组哮喘患者外周血cTfh细胞高于缓解组[(12.63±0.51)vs(10.22±0.39),P<0.05]以及健康对照组[(12.63±0.51)vs(9.54±1.71),P<0.05],而缓解组与健康对照组cTfh细胞相比差异无统计学意义[(10.22±0.39)vs(9.54±1.71),P>0.05];急性发作组哮喘患者外周血Th9细胞高于缓解组[(1.33±0.27)vs(0.71±0.35),P<0.05]以及健康对照组[(1.33±0.27)vs(0.24±0.09),P<0.05],而缓解组Th9细胞亦高于健康对照组[(0.71±0.35)vs(0.24±0.09),P<0.05]。哮喘患者cTfh和Th9细胞相关转录因子Bcl-6、PU.1 mRNA的相对表达量均显著高于健康对照组(均P<0.05)。cTfh和Th9细胞百分率与患者FEV1%成负相关(均P<0.05),与总IgE水平呈正相关(均P<0.05)。cTfh和Th9细胞在外周血中的表达率呈正相关(r=0.494,P=0.001)。研究结果表明支气管哮喘患者外周血cTfh和Th9细胞比例、两者相关转录因子均显著升高,并且这两种细胞的百分率均与哮喘病情相关,提示cTfh和Th9细胞可能参与哮喘免疫发病机制。

CalR激活副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录

【目的】研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对VI型分泌系统1 (type Ⅵ secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系。【方法】提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系。PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点。【结果】在细菌生长密度(OD600)从0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用。此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录。【结论】OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子。

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的构建针对人的增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）基因的短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）慢病毒表达载体，并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数（multiplicity of infection，MOI）值。方法以人APRIL基因为靶点，筛选出3条shRNA靶序列：shAPRILl210、shAPRILl754、shAPRILl604；各自合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGCL-GFP载体连接，构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604；将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞，经PCR及DNA测序鉴定。再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值。结果PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRILl210、LV-shAPRILl754、LV-shAPRILl604的预期结果一致，经包装产生的慢病毒滴度分别为5×10^7、6×10^7、4×10^7转导单位（TU）／ml；适合高效感染的MOI值为5。结论成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL，为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础。

群体感应系统核心调控子对副溶血弧菌mshH基因的调控研究

【目的】探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控。【方法】提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(ΔaphA和ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究AphA和OpaR对mshH基因的转录调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;将mshH启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,并将其转入WT、ΔaphA和ΔopaR中,获得LacZ实验菌株,再通过LacZ报告基因融合实验研究AphA和OpaR对mshH基因的调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;PCR扩增mshH上游启动子区DNA序列,并纯化His-AphA和His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和DNase I足迹实验,研究体外条件下His-AphA和His-OpaR对靶基因启动子区DNA片段是否具有直接的结合作用以及具体的结合位点。【结果】mshH基因的表达水平随着培养时间的延长而升高;低细菌密度时,AphA抑制mshH基因的转录,但His-AphA对mshH启动子区DNA序列没有结合活性;高细菌密度时,OpaR对mshH基因的转录具有激活作用,His-OpaR对位于mshH基因的翻译起始位点上游–160至–80 bp和–58至–19 bp之间的DNA序列具有结合活性。【结论】低细菌密度时,AphA可能是通过间接方式抑制mshH基因的转录;高细菌密度时,OpaR直接结合到mshH调控区DNA片段上,并激活其转录。