重组大肠杆菌全细胞用于苯乙酮酸的绿色生物合成

苯乙酮酸是化学合成中重要的合成砌块,可用于合成多种药物中间体,探索苯乙酮酸的绿色合成工艺具有重要的意义。以包含D-扁桃酸脱氢酶Lh DMDH编码基因的重组大肠杆菌全细胞为催化剂,考察了它在无辅酶和辅底物添加的条件下对D-扁桃酸生物转化的效果,并对催化产物进行了纯化和鉴定。结果表明,本研究成功实现了在无辅酶和辅底物添加条件下苯乙酮酸的生物合成,产物的得率和纯度分别为45%和99%左右。成果也为外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成奠定了基础。

D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

微生物磷脂酶D的克隆表达研究进展

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD,EC 3.1.4.4)是催化磷脂的磷酸二酯键水解和转磷脂酰基反应的一类酶的总称。PLD所具有的转磷脂活性使其在食品、医药以及细胞生物学等领域具有广泛的应用价值,但其大规模工业化生产受到诸多因素的限制。利用基因工程技术对磷脂酶D基因进行克隆表达,开发高产量、高纯度和高转磷脂活性的PLD资源成为当前的研究热点。本文主要对微生物PLD克隆与高效表达方面的研究进展进行分析,以期对微生物PLD的大规模生产及其相关产品的开发利用提供参考。

生活废弃油脂高效降解菌的筛选、鉴定及应用

筛选能够降解废弃生活油脂的微生物,实现丹江口库区生活污水中废弃油脂的生物降解,减少生活油脂对库区水体的污染。以大豆油为目标污染物,先进行菌种富集和驯化,然后进行中性红平板筛选及生理生化鉴定。筛选获得了一株高效降解丹江口库区生活废弃油脂土著微生物,且具有较好的环境适应性和应用潜力。经鉴定,该微生物与 Proteus mirabilis 最为接近,命名为 Proteus mirabilis NY-201801。5%(体积分数)油脂初始浓度,接种量10%,pH值7.0,在35 ℃、150 r/min下培养36 h, Proteus mirabilis NY-201801对油脂的降解率可以达到92%。同时,在库区最高水温的条件下,对5%油脂的降解率也可以达到50%。为实现库区废弃生活油脂的生物降解奠定了坚实的基础。

甲酸脱氢酶催化活性的定向进化及其高效表达

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),在NADH的再生中起重要作用。为了获得高活性的甲酸脱氢酶突变体,本研究以博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶(Candida boidinii formate dehydrogenases,CbFDH)突变体(CbFDHC23S)为亲本,进行了2轮定向进化,获得了一个比酶活性约为亲本4倍,且更适合于在生理条件下进行辅酶再生的突变体M2。然后,利用计算机辅助的手段初步阐明了其温度特性和催化效率改变的分子机制。最后,借助共表达策略进一步提高了突变体M2在大肠杆菌中的表达水平,超声裂解液中的甲酸脱氢酶活性达到45.85 U/mL,远远高于亲本单拷贝表达水平。本研究为增强NADH再生能力、降低NADH的再生成本,实现FDH偶联催化的手性醇及氨基酸衍生物等食品添加剂高效、廉价的绿色生物合成奠定理论基础。

重组大肠杆菌全细胞催化D,L-扁桃酸对映选择性制备L-苯甘氨酸

借助pACYCDuet-1和pET28a双质粒共表达系统,构建携带Agrobacteriumradiobacter来源扁桃酸消旋酶(Ar mandelate racemase,Ar MR)、Lactobacillus harbinensi来源D-扁桃酸脱氢酶(Lh D-mandelate dehydrogenase,Lh DMDH)和ExiguobacteriumsibiricumDSM17290来源L-亮氨酸脱氢酶(EsL-leucine dehydrogenase,Es LeuDH)编码基因的重组大肠杆菌,将其命名为E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDHLhDMDH:pET28a-ArMR。在低温、低浓度诱导剂的诱导下,该重组菌成功表达了具有各自催化活性的3种重组酶,其发酵液中Lh DMDH、Es LeuDH和Ar MR的活性分别为195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。以诱导后的全细胞为催化剂、D,L-扁桃酸为底物,在D,L-扁桃酸初始浓度50 mmol/L、pH 9.5的500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O缓冲液体系下,180 r/min、30℃反应48 h后,L-苯甘氨酸得率可达77.48%,其对映体过量值大于99%。本研究具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

新型R-扁桃酸脱氢酶的基因挖掘及表达鉴定

R-扁桃酸脱氢酶在苯乙酮酸的生物合成中起着关键的作用,挖掘具有高催化活性及稳定性的新型R-扁桃酸脱氢酶具有重要的意义。为了获得理想的R-扁桃酸脱氢酶,采用了基因组挖矿技术从Lactobacillus harbinensis菌株中获得了一个新型的R-扁桃酸脱氢酶LhDMDH,重组LhDMDH的比酶活高达1264.3 U/mg,约为探针的4倍,在已报道的R-扁桃酸脱氢酶中处于领先水平。同时,考察了4个重组酶主要的酶学特性,它们的最适反应温度在25-30℃,最适反应pH在9.0-9.5。动力学参数的结果表明,LhDMDH对底物的K_（cat）值为30.28 S^-1,明显高于其它重组酶。此外,底物谱分析的结果也表明LhDMDH在外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成中更具优势。在R-扁桃酸脱氢酶基因挖掘方面取得了较为理想的结果,为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它酶的挖掘提供了可资借鉴的经验。

CPC乙酰化酶底物结合区域Loop上脯氨酸对其催化特性的影响

低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势,开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶,在前期的研究基础上,以先前获得的CA IIIM为亲本,借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域,并利用py MOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基,分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助p ET32a质粒在E.coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究,除P272G外,其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38U/mg,较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外,分别考察了亲本及突变体的温度稳定性,它们之间无明显的差异。然后,在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究,结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。由此可见在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果,为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。