高通量基因测序仪行业标准的验证

目的按照制定的高通量基因测序仪行业标准的性能指标,使用测序通量<20 Gb/run且≥2 Gb/run高通量基因测序仪进行验证。方法取测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品的DNA,经过DNA片段化处理、末端修复、接头连接和文库扩增等步骤后构建文库;然后将文库PCR扩增;最后使用测序反应通用试剂盒(半导体法)和BES4000基因测序仪进行测序。结果测序覆盖率为99.99%,测序平均深度为166×。国家参考品中人基因组DNA样本的比对率为86.14%,碱基测序准确率为98.97%;SNP、Indel准确率为95.40%;SNP、Indel灵敏度为85.75%。人基因组DNA、人乳头瘤病毒11型基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA和高GC含量细菌基因组DNA样本的一致序列准确率分别为99.94%、100%、99.95%和99.88%。国家参考品进行三次重复测序,重复性结果均符合要求。结论制定的行业标准可以用于高通量基因测序仪的性能评价,为产品注册检定及上市后监督管理提供依据。

东莞户籍33810例新生儿听力筛查联合耳聋基因检测与分析

目的了解分析东莞地区新生儿常见耳聋基因的突变类型和突变携带率,并对听力筛查和耳聋基因联合检测进行评价。方法对2016年1月至2017年2月在东莞辖区内出生的33810例户籍新生儿同时进行听力筛查和耳聋基因检测,听力筛查包括耳声发射和听性脑干反应,耳聋基因检测采用耳聋基因芯片(微阵列芯片法)对我国常见的致聋基因GJB2(c.235del C,c.299_300del AT,c.176_191del16,c.35del G)、SLC26A4(IVS7-2A>G,c.2168A>G)、线粒体12Sr RNA(m.1555A>G,m.1494C>T)和GJB3(c.538C>T)进行检测。结果 33810例新生儿共检出1145个等位基因突变,突变携带率约为3.39%。其中GJB2突变661个,突变携带率约1.96%;SLC26A4突变364个,突变携带率约1.08%;线粒体DNA12Sr RNA突变74个,突变携带率约0.22%;GJB3突变46个,突变携带率约0.14%。在6242例新生儿听力筛查结果中,听力筛查未通过103例,未通过率1.65%。结论 c.235del C、IVS7-2A>G是东莞地区新生儿耳聋基因突变的主要类型。开展新生儿听力筛查与耳聋基因联合检测有助于了解本地区耳聋基因携带情况及患儿听力状况,提早发现先天性耳聋患者,高度预警药物性耳聋和迟发性耳聋,做到早发现、早诊断、早干预、早治疗,对降低耳聋发生率有重要意义。

半导体基因测序技术筛查地中海贫血的临床应用价值

目的:探讨半导体基因测序技术在地中海贫血基因筛查中的应用价值。方法:采集随机就诊者的静脉血197例作为前瞻性样本;随机选择临床确诊样本200例作为既往样本。同时采用半导体基因测序技术和PCR技术进行检测与分析,比较两种检测方法结果的差异。结果:前瞻性样本中,PCR技术检出地中海贫血基因突变共22例,其中α-突变18例,β-突变3例,α合并β-突变1例;采用半导体基因测序技术除检出以上基因位点外,另发现罕见型地中海贫血6例。既往样本共200例,其中α-突变118例,β-突变65例,α合并β-突变17例,采用半导体基因测序技术另发现突变位点1例。统计分析结果显示,PCR技术与半导体基因测序技术总符合率为98.5%,Kappa=0.97(≥0.8)。结论:半导体基因测序技术不仅能够覆盖PCR技术能检测到的所有位点,而且可检测到地中海贫血的罕见基因突变位点,且检测成本低,仪器价格低廉,有利于地中海贫血的普查。

胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(高通量测序法)行业标准的制定

目的制定胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(高通量测序法)行业标准,使用BioelectronSeq 4000等不同测序平台的试剂盒进行验证,评价标准的可行性。方法使用高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体(T21、T18和T13)国家参考品,按照拟定行业标准的要求进行验证。首先提取国家参考品的血浆游离DNA,制备文库,上机测序,通过生物信息软件分析获得染色体数目的结果。结果胎儿游离DNA浓度为10%和5%的国家阳性参考品结果均为相应染色体三体;40个3.5%浓度的国家检测限参考品,其中至少20个参考品结果为相应染色体三体;嵌合比例为70%和30%的国家嵌合体参考品均为相应染色体三体;国家微缺失微重复参考品中18号染色体微重复的参考品均为18三体,其余参考品结果均不是21、18和13三体;染色体正常或其他染色体异常的国家阴性参考品,结果均不是21、18和13三体。结论制定的行业标准可以用于该类产品试剂盒的质量评价,为产品注册检验及上市后监督管理提供依据。

8号染色体三体、嵌合及单亲二体的遗传学诊断及临床特征

8号染色体属于C组中等大小的亚中着丝粒染色体,常可由于减数分裂和细胞分裂后期的染色体不分离导致。完全型的8号染色体三体大多会导致胚胎停育或自然流产,儿童或成人多见于骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)、急性髓性白血病(acute myelocytic leukemia,AML)、慢性髓性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)、骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease,MPD)等髓系恶性血液病的研究,但也有正常存活无异常临床表型的报道;嵌合型8号染色体三体是一种较为罕见的常染色体异常,具有高度表型异质性和遗传异质性;8号染色体单亲二体相关报道较少。我们汇总了文献报道及我们4家合作单位未发表的检测数据,对8号染色体以上三类遗传病从疾病概述、临床特征、治疗与预后、实验室检测、鉴别诊断和再发风险等进行总结,以期为临床医生对此类疾病的诊断及遗传咨询提供帮助。

东莞地区16182名个体18个耳聋易感基因100个变异位点的测序筛查

目的确定东莞地区耳聋基因的变异类型和携带率。方法收集新生儿及门诊筛查的16182名个体,新生儿采集足跟血片,非新生儿采集外周静脉血样,对18个耳聋易感基因的100种变异进行检测。结果共检出1631例耳聋基因变异,总体检出率为10.08%,其中5例为纯合变异。SLC26A4基因变异的检出率最高(5.22%),共845例,其余依次为GJB2(673例,4.16%)、GJB3(100例,0.62%)、TMC1(12例,0.07%)、MYO15A(1例,0.01%)。GJB2基因c.235delC变异检出率最高(3.24%),共524例,其次为SLC26A4基因IVS7-2A>G变异(270例,1.67%)。33名个体(0.20%)同时携带两个变异,其中7例(0.04%)携带同一基因的复合杂合变异。结论扩大耳聋易感基因变异的筛查范围有助于了解携带情况及耳聋的遗传因素,对提早发现先天性耳聋、对受检者提供干预和遗传咨询具有重要的价值。

PIK3CA和TP53基因突变与乳腺癌分子分型及组织学分级相关性的研究

目的分析乳腺癌突变基因与乳腺癌分子分型和组织学分级的关系,为进一步治疗提供参考依据。方法回顾性收集2016年2月至2017年8月期间广东省东莞市妇幼保健院和东莞市厚街医院诊治的46例未行化疗的乳腺癌患者的病理切片标本,采用免疫组织化学染色技术检测肿瘤组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体-2(HER-2)的表达,并对病理切片组织进行分级。使用多重PCR技术,扩增所选择的50个肿瘤相关基因的207个热点突变区域,然后采取高通量的半导体测序平台(SSP)进行检测。结果 46例乳腺癌患者的组织学分级:Ⅰ级8例,Ⅱ级18例,Ⅲ级20例;ER/PR/HER-2状态分型:Luminal A型9例,Luminal B型23例,HER-2过表达型9例,besal-like型5例。所有样本共检测到8种基因的33个位点突变,包括AKT1、APC、BRAF、CDKN2A、KRAS、PTEN、PIK3CA和TP53基因,其中PIK3CA基因突变24例,TP53基因突变18例,CDKN2A基因突变2例,其余突变基因各检出1例。乳腺癌的总基因突变情况与组织学分级和分子分型均无关(P>0.05);PIK3CA基因突变与乳腺癌的组织学分级相关,组织学分级越低PIK3CA基因的突变频率越高(P<0.05)。结论 PIK3CA基因在组织学分级Ⅰ级患者中的突变率明显增高。

孕前常见耳聋基因突变筛查对于预防和干预先天性耳聋的价值

目的探讨孕前耳聋基因突变筛查对于预防和干预先天性耳聋的价值。方法应用实时荧光定量PCR技术，对2168对行孕前检查且听力正常的夫妇共4336人进行GJB2（c．235delC、c．299—300delAT）、线粒体DNA12SrRNA（c．1494C〉T、C．1555A〉G）和SLC26A4（C．2168A〉G、c．IVS7～2A〉G）基因的6个致聋突变进行筛查，对双方均携带杂合突变的6对夫妻进行孕中期产前诊断。结果在4336人中，共检测出176例突变携带者，总携带率为4．06％，其中GJB2基因C．235del C位点突变率为0．91％、C．299—300delAT位点突变率为0．20％；SLC26A4基因c．IVS7—2A〉G位点突变率为0．68％、C．2168A〉G位点突变率为0．11％；线粒~4I；DNA12SrRNA基因c．1555A〉G位点突变率为0．1％、C．1494C〉T位点突变率为0．01％。6对双方携带同一基因杂合突变夫妇的产前诊断结果提示6例胎儿染色体核型均正常，测序结果显示2例胎儿携带GJB2基因C．235delC纯合突变，1例携带GJB2基因C．235delC杂合突变，1例携带GJB2基因C．299—300delAT杂合突变，2例携带SLC26A4基因12．IVs7—2A〉G杂合突变。结论孕前耳聋基因突变筛查能够对先天性耳聋进行产前诊断和早期预防，有效降低遗传性耳聋的发病率。

染色体嵌合体的产前诊断与遗传咨询共识

随着高敏感性遗传学检测技术在产前诊断领域的广泛应用,产前染色体嵌合体的检出越来越普遍,其诊断标准、遗传咨询原则和临床处理方案在不同单位之间可能存在不同程度的差异。这不仅给实验室、产前咨询医师或胎儿医学医师的诊疗工作带来了挑战,而且也给孕妇及其亲属造成了焦虑与困扰。鉴于此,本组专家就染色体嵌合体的产前遗传学诊断与遗传咨询达成共识,以期建立标准化的诊疗规范,从而更好地指导临床诊疗工作。

孕妇外周血浆胎儿游离DNA高通量测序筛查致病性拷贝数变异的技术标准共识

由致病性拷贝数变异(pathogenic copy number variations,pCNV)导致的基因组病是出生缺陷的一个重要遗传学病因。近年来,随着基于孕妇血浆胎儿游离DNA高通量测序技术的发展、生物信息分析流程的完善以及大样本数据的积累,无创产前筛查(noninvasive prenatal screening,NIPS)胎儿pCNV疾病已开始应用于临床,国内对此技术的规范应用亟需专业的指导意见。基于此,本组专家就筛查的目标疾病和全流程临床规范应用细节达成技术共识,以期达到NIPS筛查pCNV疾病规范应用的目的。

无创产前检测发现双胎之一为21三体一例

孕妇37岁，表型及智力均正常，无不良嗜好，丈夫染色体核型正常。患者通过促排卵怀孕，为双胎妊娠，无创产前检测（non-invasive prenatal testing,NIPT） ：孕17^＋周时经其知情同意，于我院抽外周血进行无创产前检测。

严重致残致死性染色体病的快速诊断方法学研究及临床应用

染色体病是一类由染色体数目异常或结构畸变所致的疾病,染色体病大多数严重致残甚至致死,其共同的临床表现主要为先天性智力低下,生长发育迟缓,并伴有五官、四肢和内脏等多发畸形,也是先天性心脏病、神经管畸形、唇腭裂等主要出生缺陷的主要病因之一,给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担.

一例3p26．3-pter缺失及7q31．33-qter重复患儿的临床表型与遗传学分析

目的明确1例发育落后合并多发畸形患儿染色体拷贝数变异（copy numbervariants，CNVs）的性质及来源，并分析其与表型的相关性。方法应用常规G显带分析患儿及其父母的外周血染色体核型，应用二代测序（next generation sequencing，NGS）技术对患儿进行检测。结果G显带分析显示患儿的3号染色体存在结构异常，其父亲的染色体核型为46，XY，t（3；7）（p26；q31），其母亲核型未见异常。NGS检测显示患儿染色体3p26．3-pter区存在约2．16Mb的微缺失，7q31．33-qter区存在约34．24Mb的重复。结论患儿3号染色体的结构异常源自其父亲的t（3；7）平衡易位，其核型为46，XY，der（3）t（3；7）（p26．3；q31．33）pat。3p26．3-pter区微缺失和7q31．33-qter区重复是导致患儿异常表型的原因。

无创产前检测发现18q缺失综合征胎儿一例

本文对一例产前血清学筛查临界高风险孕妇进行无创产前检测（高通量DNA测序法），结果显示该例胎儿21号、18号、13号染色体无三体异常，但存在18号染色体局部缺失del（18）（q21．33q23）。本研究对其羊水细胞进行染色体核型分析和高通量测序，并对胎儿进行系统超声检查，同时分析其亲代外周血的染色体核型。结果确证了无创产前检测的发现，即胎儿l8号染色体q21．33-q23区域存在约16．5Mb的缺失，属于18q缺失综合征。羊水细胞高通量测序还发现胎儿1号染色体短臂p35．2-p35．1位置存在长约0．7Mb的微重复。该孕妇于孕26周行引产术终止妊娠。