大豆生物活性物质降胆固醇作用的实验研究

目的：通过经胃给高脂大鼠大豆皂甙和大豆异黄酮30天，观察大豆皂甙和大豆异黄酮大豆成分降血脂的作用。方法：用高脂饲料喂饲SD大鼠20天，造高脂血症大鼠模型。成模后，给高脂大鼠分别用大豆皂甙和大豆异黄酮灌胃，连续30天后，检测大鼠血液中胆固醇和甘油三酯的水平。结果：1，用大豆皂甙灌胃高脂SD大鼠30天后，与对照组比较，喂大豆皂甙3μg/g剂量组的大鼠血液胆固醇水平显著降低（P＜0．001）。2，用大豆异黄酮灌胃高脂SD大鼠30天后，与对照组比较，各剂量组大鼠血液胆固醇水平均显著降低（P＜0．001和P＜0．01），喂大豆异黄酮3μg/g剂量组的大鼠血液甘油三酯水平也显著降低（P＜0．05）。结论：大豆皂甙和大豆异黄酮具有降低血液胆固醇的作用，大豆异黄酮也具有降低血液甘油三酯的作用。

N-乙酰半胱氨酸在大鼠心肌缺血损伤中保护作用的研究

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对大鼠心肌缺血损伤的保护作用。方法:采用150 mg.kg-1.d-1异丙肾上腺素皮下注射建立Wistar大鼠心肌缺血损伤的模型,以心脏超声、DHE染色、Western blot、实时定量RT-PCR、免疫组化等实验方法,检测NAC对心功能,氧自由基、细胞凋亡、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)表达、血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)表达的影响。结果:大鼠皮下注射异丙肾上腺素后出现心肌缺血损伤,血清LDH增高,心肌组织氧自由基生成明显升高,心肌细胞凋亡明显增加,SOD-1减少,PDGFRβ表达增加,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05);与异丙肾上腺素处理组比较,NAC(200 mg.kg-1.d-1)预处理后心肌损伤减轻,氧自由基生成降低,凋亡细胞减少,PDGFRβ表达降低,SOD-1表达水平明显增高。结论:抗氧化剂NAC可以通过抑制心肌氧化应激,减少氧自由基生成和心肌细胞凋亡,对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌缺血损伤发挥保护作用。

PDLIM5、SLC22A3和NKX3-1基因与前列腺癌患病风险的关联性研究

目的:探索PDLIM5基因(rs17021918,T)、SLC22A3基因(rs9364554,C)和NKX3-1基因(rs1512268,A)与中国人群前列腺癌(PCa)患病风险的关联。方法:采用病例-对照研究,包括124例PCa患者和138例正常对照者,对PDLIM5基因(rs17021918,T)﹑SLC22A3基因(rs9364554,C)和NKX3-1基因(rs1512268,A)进行两组间的等位基因及基因型差异分析,探讨各基因与患者的BMI、Gleason评分、PSA浓度、肿瘤分期、年龄等临床表型之间的关联。采用MDR方法进行基因-基因交互作用分析。结果:①PDLIM5﹑SLC22A3和NKX3-1基因的风险等位基因和基因型的频率在病例组和对照间组间的分布无显著性差异(P>0.05)。②3个位点与PCa的发病年龄、Gleason评分、PSA浓度以及病理分期等指标均无显著相关性(P>0.05)。③采用MDR方法分析PDLIM5基因、SLC22A3基因和NKX3-1基因的3个多态性位点的交互作用发现PDLIM5基因和NKX3-1基因之间,可能不存在有基因-基因交互作用,树状图分析说明PDLIM5基因与NKX3-1基因可能有协同作用。结论:PDLIM5、SLC22A3和NKX3-1基因可能与中国人群PCa患病风险无关联。而PDLIM5基因和NKX3-1基因之间对PCa患病风险的影响可能有协同作用。

小鼠肝脏胰岛素受体的特异性敲除降低极低密度脂蛋白中三酰甘油分泌的研究

目的:建立肝组织特异性胰岛素受体急性缺失的动物模型,分析胰岛素信号缺失对三酰甘油代谢的影响。方法:在构建腺病毒时,利用Cre-LoxP系统机制,在Cre重组酶基因的上游插入肝组织特异性表达的白蛋白基因启动子。扩增纯化病毒,经小鼠尾静脉注射病毒14 d后,收集小鼠血浆,测定极低密度脂蛋白三酰甘油分泌速率,抽提肝脏脂质并用酶法检测脂质含量,用免疫印迹法分析胰岛素受体和脂代谢相关基因在肝脏内的表达。结果:成功构建了肝脏特异性胰岛素受体急性缺失动物模型。胰岛素信号缺失显著降低了小鼠肝脏的极低密度脂蛋白三酰甘油的分泌速度,同时也下调了肝脏脂肪酸合成相关基因和极低密度脂蛋白形成相关基因的表达。结论:肝脏胰岛素信号急性缺失降低极低密度脂蛋白中三酰甘油的分泌速度,这种变化可能和肝脏内脂肪酸的合成速度下降有关。

血清不同温育条件对高密度脂蛋白胆固醇的稳定性影响研究

目的探讨血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL—C）在不同温度、时间下的储存稳定性。方法2015年5月自卫生部北京医院征集健康志愿者10人（男性4人，女性6人，年龄24～59岁），将收集的血清在4℃温育24h，25℃温育0，1，8和24h[分别含和不含卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）抑制剂]，HPLC法测定血清总胆固醇（TC），总游离胆固醇（TFC），HDL—C以及HDL游离胆固醇（HDL—FC）。使用微软EXCEL软件进行结果分析。结果血清在4℃温育24h，造成HDL—FC和HDL—C变化（平均为-6．91％和-2．17％）；25℃温育24h造成TFC，HDL—FC及HDL广C的变化（平均为-13．70％，-25．88％和-1．53％）；25℃下LCAT抑制剂完全抑制TFC的降低、部分抑制HDL—FC的降低，使HDL-C降低幅度更大。结论血清贮存可造成胆固醇变化，这种变化取决于LCAT，胆固醇酯转移蛋白（CETP）的活性以及FC在脂蛋白之间的转移。因此，为提高血脂测定结果的准确性，应尽量减少不必要的血清贮存。

8-氧鸟嘌呤脱氧核苷在快速老化小鼠SAMP8海马中表达的增龄性变化研究

目的观察8-氧鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxo-dG)在快速老化小鼠SAMP8海马不同区域的表达,探讨其变化与SAMP8增龄的关系。方法选用1、4、8、12月龄快速老化小鼠SAMP8(每组各6只),对照组为同龄抗快速老化小鼠SAMR1(每组各6只),用免疫组化法检测海马不同区域内8-oxo-dG的表达水平。结果8-oxo-dG在海马不同区域均有表达,且主要在海马神经细胞胞核内表达。对照组SAMR1小鼠海马各区域8-oxo-dG的吸光度定量结果显示各月龄组间无统计学差异(P>0.05);1、4月龄组SAMP8小鼠海马各区域8-oxo-dG的吸光度定量结果与同龄匹配的SAMR1小鼠间无统计学差异(P>0.05);8、12月龄组SAMP8小鼠海马各区域8-oxo-dG的吸光度定量结果分别显著高于1月龄和4月龄组(P<0.05),也分别显著高于同龄SAMP1对照组(P<0.05)。结论8-oxo-dG在SAMP8快速老化小鼠海马中的水平随增龄而显著增高。

人载脂蛋白AV原核表达载体的构建与纯化研究

目的:构建人载脂蛋白AV(apolipoprotein AV,apoAV)的原核载体并表达纯化该蛋白。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,以反转录的cDNA第一链为模板,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到含有编码apoAV完整成熟肽段的PCR片段。PCR产物和原核表达载体pET30b经核酸内切酶双切后连接,连接产物经转化至大肠杆菌感受态细胞Top10,挑选克隆测序。重组质粒pET30b-apoAV转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化诱导表达条件,重组的apoAV经镍离子螯合树脂纯化获得。结果:经测序证实人apoAV目的基因成功克隆入pET30b原核表达载体中,经过IPTG诱导有约40KD的特异性蛋白表达,与预期大小一致。该蛋白在IPTG诱导下的最佳表达时间为5h,最佳浓度在31.3μmol/L。纯化的apoAV纯度在95%以上,产率约为15 mg/L。结论:成功构建人apoAV的原核表达载体,实现了高效表达和纯化,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。

肌细胞增强因子2A CAG重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性研究

目的构建肌细胞增强因子2A(MEF2A)/绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,检测其在Hela和293T细胞中的表达,探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性。方法用PCR法扩增野生型MEF2A基因全长cDNA序列,以及其他含4～15个CAG三联核苷酸重复序列的变异型MEF2A全长cDNA序列;将上述12种MEF2A全长cDNA序列分别克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFP-Cl,构建MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A、变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-CAGr;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,荧光显微镜检测GFP蛋白的表达。结果构建成功与GFP融合的野生型及变异型MEF2A蛋白表达质粒共12种用于细胞学定位功能研究,体外实验结果显示,上述12种MEF2A蛋白均定位于细胞核内。结论 MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变不会影响其细胞内的定位功能。

血清支链和芳香族氨基酸同位素稀释质谱检测法的建立和应用研究

目的 建立同位素稀释液相色谱串联质谱（ID-LC/MS/MS）同时测定血清五种支链和芳香族氨基酸（即缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）的方法,分析其与糖尿病及心血管病危险因素的关系.方法 采用同位素标记被测物作内标,沉淀蛋白后LC/MS/MS分离检测,标准曲线定量;对不同水平血清样本进行五次重复分析,每次每种血清重复分析3份,以考察方法的精密度;测定血清样本添加不同浓度标准品的加样回收率.收集2010年10～12月111例健康志愿者空腹静脉血,离心分离血清,测定血清支链和芳香族氨基酸及传统危险因素指标水平,进行相关性分析.结果 五种氨基酸在该试验条件下分离良好,分析时间约4 min;测定不同血清水平的批内变异系数（CV）为1.56%（1.07%～2.02%）,总CV为2.03%（1.14%～3.01%）;多次试验的加样回收率范围为98.34%～103.25%.测定111例健康人血清支链和芳香族氨基酸水平与体重指数、空腹血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇酯化速率、肌酐、尿酸、载脂蛋白CII和CIII以及超敏C反应蛋白显著正相关（t=0.000 02～0.046,P值均〈0.05）;与高密度脂蛋白胆固醇显著负相关（t=0.000 5～0.048,P值均〈0.05）.结论 该研究建立了简便精密的ID-LC/MS/MS测定血清支链和芳香族氨基酸的方法,有望在糖尿病和心血管病危险分析中发挥作用.

MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学活性研究

目的建立MEF2A蛋白细胞学定位和转录激活活性的体外检测体系,探讨MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学意义。方法构建含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)报告基因真核表达载体的MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A和变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-Mut;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的定位表达情况。构建含HRC基因启动子/增强子序列的萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-HRC enhancer,将该质粒与野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA,或变异型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA-Mut,以及海肾荧光素酶质粒pRL-TK,用脂质体转染法共转染于293T细胞,Western blot检测MEF2A蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果本研究建立的细胞学定位和转录激活活性检测体系均可有效检测MEF2A蛋白的生物学活性;与野生型MEF2A蛋白相比,四种MEF2A特殊变异蛋白的细胞学定位和转录激活活性均无显著性差异。结论本研究发现的MEF2A基因第11号外显子四个含特殊变异位点的MEF2A变异蛋白不会影响其细胞学定位和转录激活的生物学活性。

线粒体突变和心血管疾病等的关系研究进展

线粒体是使细胞能量生成的场所,线粒体基因组(mitochondrial DNA,mtDNA)编码参与线粒体呼吸链的13个蛋白亚基,2个rRNA和22个tRNA。mtDNA突变是引起多因素疾病和部分遗传疾病的重要原因之一,本文介绍线粒体基因组学、mtDNA疾病模型,mtDNA突变导致心血管疾病等的临床特征及其治疗和预防的研究进展。

5-脂氧合酶激活蛋白小干扰RNA诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究

目的:研究5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的表达抑制对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用。方法:通过小干扰RNA(siRNA)抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中FLAP的表达,用流式细胞仪检测膜联蛋白(annexin)-Ⅴ标记的早期凋亡细胞,用Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白的水平。结果:转染了FLAP siRNA的乳腺癌细胞,24 h后FLAP的表达被抑制,17%的细胞出现早期凋亡;48 h时早期凋亡细胞增加到32.1%;72 h时早期凋亡细胞下降到13.8%,而死亡或凋亡晚期细胞占到61.3%。在细胞凋亡过程中,Bcl-2水平下降,而细胞色素c、胱冬蛋白酶(caspase)-3的水平逐渐增高。结论:FLAP的表达抑制可以诱导乳腺癌细胞通过Bcl-2和胱冬蛋白酶-3途径发生凋亡。

rs6983267和rs1447295与北京地区前列腺癌的关联研究

目的:探讨染色体8q24两个单核苷酸多态性位点(SNPs)rs6983267和rs1447295,与北京地区前列腺癌(PCa)的相关性。方法:采用病例-对照研究,入选了154例PCa患者和138名正常对照者,检测2个SNPs在病例组和对照组间的等位基因及基因型的分布情况,并分析危险基因型的累积效应。结果:rs6983267有TT、GT及GG 3种基因型,在病例组的分布分别为33.1%、46.4%及20.5%,在对照组的分布分别为32.6%、48.5%及18.9%;rs1447295也有AA、AC及CC 3种基因型,在病例组的分布分别为3.3%、38.2%及58.6%,在对照组的分布分别为1.5%、32.1%及66.4%。2个SNPs的风险等位基因和基因型频率在病例组和对照组间的分布差异无统计学意义,P>0.05。与不具有风险基因型的个体相比,具有1个和同时具有2个风险基因型的个体PCa的发病风险虽然分别提高了1.231和1.571倍,但差异无统计学意义,P>0.05。结论:SNPs rs6983267和rs1447295可能与北京地区PCa的易感性无关。

阿魏酸通过抑制核因子κB信号途径降低肿瘤坏死因子α诱导的人血管内皮细胞氧化应激及黏附分子表达

目的通过检测人脐静脉内皮细胞的氧化应激、细胞黏附分子和炎症相关信号分子表达,探讨阿魏酸在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的血管内皮损伤中的保护作用和机制。方法以人脐静脉内皮细胞为研究模型,给予阿魏酸预处理,在基础或者TNF-α刺激条件下,蛋白质免疫印记法检测细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达和炎症相关细胞信号分子;MTT法检测内皮细胞活性;Hoechst 33342细胞核染色检测细胞凋亡比率;以DHE染色检测氧自由基(ROS)生成;单核细胞和血管内皮细胞黏附实验检测血管内皮细胞的黏附功能;以蛋白质免疫印记法和细胞免疫荧光实验检测核因子κB(NF-κB)的活化。结果 TNF-α可以明显增加血管内皮细胞氧自由基生成及ICAM-1和VCAM-1的表达,并且可以明显激活NF-κB,促进其核转位。阿魏酸可以明显抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞氧自由基生成及ICAM-1和VCAM-1表达升高,抑制NF-κB活化和核转位。结论阿魏酸可以通过抑制NF-κB信号途径减轻TNF-α导致的血管内皮细胞氧自由基增高、黏附分子表达,抑制炎性因子导致的细胞损伤。

美国医改及世界应对老龄化对策分析

1 美国医改 1．1美国医疗保障发展史1965年，美国国会通过了医疗照顾（Medicare）和医疗援助（Medicaid）两大公共医疗保障计划，标志着美国政府全面干预医疗保障事务的开始^[1]。美国医改历时一个世纪以来，从号召为美国提供“人人都能负担的医疗”的杜鲁门总统，

Niemann-Pick C1-Like 1表达缺陷缓解肝X受体激动剂诱导的小鼠肝脏脂肪性变

目的探讨Niemann-Pick C1-Like 1在肝X受体激动剂诱导的肝脏脂肪性变中的作用。方法给C57BL/6小鼠和Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠喂食0.015%胆固醇饮食21天,胃饲溶剂或肝X受体激动剂T0901317一周后,收集小鼠肝脏,称重;抽提肝脏脂质并用酶法检测脂质含量;用实时定量聚合酶链反应法检测肝脏表达与脂肪合成相关基因固醇调节元件结合蛋白1c、脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1的mRNA水平。结果在胃饲T0901317一周后,C57BL/6小鼠肝脏由1.1±0.1g增大到2.8±0.3g,肝脏甘油三酯含量由34.2±18.1mg/g增至232.2±67.9mg/g,固醇调节元件结合蛋白1c、脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1mRNA水平在肝脏的表达也显著增高;而Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠肝脏由0.9±0.1g增大到1.5±0.1g,肝脏甘油三酯含量由43.7±26.5mg/g增至104.9±62.1mg/g,脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1mRNA水平在肝脏的表达也显著增高。但在T0901317诱导下,Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠肝脏脂肪酸合成酶mRNA水平仍比C57BL/6小鼠低63%。结论Niemann-Pick C1-Like 1表达缺陷降低肝X受体激动剂诱导的肝脏固醇调节元件结合蛋白1c和脂肪酸合成酶的表达,缓解小鼠肝脏脂肪性变。

聚乙二醇-过氧化氢酶在小鼠心肌肥厚和损伤中的保护作用

目的观察聚乙二醇-过氧化氢酶在异丙肾上腺素所致小鼠心肌肥厚和损伤中的保护作用。方法以异丙肾上腺素建立C57BL/6小鼠心肌肥厚和心肌损伤的模型,通过二氢乙啶染色、蛋白质印迹法、实时定量逆转录聚合酶链反应、Masson Trichrome染色等实验,检测聚乙二醇-过氧化氢酶在异丙肾上腺素所致小鼠心肌肥厚和损伤模型中对氧自由基生成、细胞凋亡、心肌纤维化、超氧化物歧化酶1(SOD-1)表达的影响。结果小鼠异丙肾上腺素皮下注射后,发生心肌肥厚和缺血损伤,心肌组织氧自由基生成明显升高,SOD-1的表达明显降低,心肌细胞凋亡增加,发生心肌纤维化,与对照组对比差异有统计学意义(均为P<0.01);与异丙肾上腺素处理组比较,聚乙二醇-过氧化氢酶(30 000 U.kg-1.d-1)预处理组心肌肥厚改善,氧自由基生成明显降低,SOD-1水平明显提高,细胞凋亡减少,心肌纤维化降低,差异有统计学意义(均为P<0.05)。结论抗氧化剂聚乙二醇-过氧化氢酶可以有效进入心肌组织,抑制氧自由基生成、减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化,对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚和损伤具有保护作用。

MTH1基因的低表达对HeLa细胞内RNA氧化程度的影响

目的建立敲减MTH1基因的HeLa细胞稳定细胞株,研究MTH1基因的低表达对HeLa细胞内RNA氧化程度的影响。方法设计并合成针对MTH1基因的3条siRNA,分别转染HeLa细胞,选择干扰效果最为理想的靶序列连接入反转录病毒载体Retro-Q,在293T细胞内包装病毒颗粒,将病毒转染HeLa细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性克隆株,用western b lot技术检测克隆株的MTH1的表达量以确定干扰效果最理想的稳定细胞株,用API5000型质谱仪检测稳定细胞株RNA中的8-oxoG与G的含量以评价RNA的氧化程度。结果本研究设计的3条siRNA中有2条干扰效率可达90%以上,所建立的敲减MTH1基因HeLa细胞稳定细胞株的干扰效果达80%以上,质谱检测结果表明MTH1基因低表达的稳定细胞株每106个G中含有14.9个8-oxoG,而对照细胞中则仅含9.7个8-oxoG。结论 MTH1基因的低表达可引起HeLa细胞中RNA氧化程度明显升高。

肝脏表达的Niemann-Pick C1-Like 1调节小鼠的胆汁胆固醇浓度

目的:探讨人(NPC1L1)在小鼠肝脏的过表达对胆汁胆固醇重吸收的影响。方法:通过杂交NPC1L1基因敲除小鼠(L1-KO)与肝脏过表达人的NPC1L1的转基因小鼠(L1-Tg),获得无小鼠自身NPC1L1基因表达、在肝脏过表达或不表达人NPC1L1基因的小鼠(L1-Tgliv+和L1-Tgliv-)。给予L1-Tgliv+小鼠(实验组)及L1-Tgliv-小鼠(对照组)含0.2%胆固醇的饮食并测定2组小鼠胆汁的脂质分泌、血浆的脂质水平和粪便核心固醇的分泌。结果:与L1-Tgliv-小鼠相比,L1-Tgliv+小鼠的胆汁胆固醇水平降低了90%,同时粪便核心固醇的分泌也降低了10%,而血浆总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯水平分别升高了38.6%、47.6%和36.6%。结论:小鼠肝脏NPC1L1的过表达可提高肝脏对胆汁中胆固醇的重吸收。