中国汉族人群CYP2C9常见多态性位点的检测及其与国外其他人群的比较研究

目的检测中国汉族人群细胞色素P450 2C9(CYP2C9)常见多态性位点的等位基因,为药物基因组学研究提供理论依据。方法用聚合酶链反应产物直接测序和基因克隆测序法对2127例中国汉族人群CYP2C9基因常见多态性位点CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因进行检测,明确其在中国汉族人群中的等位基因及基因型频率分布,并与国外不同人群基因多态性进行比较研究。结果中国汉族人群CYP2C9基因常见等位基因CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3的等位基因频率分别为96.94%、0.14%、2.92%,常见基因型CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*2、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3的基因型频率分别为94.12%、0.28%、5.36%、0.24%。结论中国汉族人群CYP2C9基因中以CYP2C9*1等位基因为最常见,CYP2C9*2和CYP2C9*3是中国汉族人群罕见等位基因;中国人群CYP2C9基因的等位基因频率与日本人群相近,与法国、西班牙和意大利等欧洲人群差异有统计学意义,该研究结果将为我国的临床药物基因组学研究提供有价值的理论依据。

产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR的临床应用前研究

目的探讨产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的意义,为该法的临床应用提供可靠的技术依据。方法将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0×1011CFU(菌落形成单位)/ml]连续10倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0×101～5.0×109CFU/g梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。结果实时荧光双重TaqMan PCR法对O1群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测灵敏度为1.0×103CFU(5.0×104CFU/g)每反应体系,其检测线性范围为1.0×103～1.0×108CFU每反应体系;在稳定性评价中,对含菌量1.0×103～1.0×108CFU每反应体系模拟带菌者粪便标本DNA进行3次重复检测的结果显示,ctxA基因扩增反应Ct值的变异系数为0.54%～1.36%,rfb-O1基因扩增反应Ct值的变异系数为1.65%～3.75%;在特异性评价中,3名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线。结论产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。

结直肠癌淋巴结转移与APC、p53和K-ras基因变异的相关性研究

目的探讨结直肠癌淋巴结转移与APC、p53和K-ras基因变异的相关性。方法用组织DNA抽提试剂盒提取32例淋巴结转移和20例无淋巴结转移的结直肠癌组织DNA,用DHPLC法对APC基因第15号外显子突变富集区(mutation clus-ter region,MCR)和p53基因的第4～9外显子进行基因变异初筛,对K-ras第12、13和61密码子采用PCR产物直接测序进行基因变异初筛,并用基因克隆测序法进行各变异位点确认。结果 APC基因在淋巴结转移患者癌组织中的突变频率显著高于无淋巴结转移患者(53.1%vs 15.0%P=0.006),在Ⅲ和Ⅳ期患者癌组织中突变频率显著高于Ⅰ和Ⅱ期患者(60.0%vs 10.5%,P=0.001),在肝转移患者癌组织中的突变频率显著高于无肝转移患者(85.7%vs 31.1%,P=0.006)。结论本研究结果显示APC基因MCR的基因变异可能是结直肠癌淋巴结转移的重要生物标志,也可能是临床分级及肝转移的重要生物标志。

MTH2和MTH3蛋白在快速老化模型鼠SAMP8胸腺中增龄性表达的比较研究

目的检测抗核酸氧化酶蛋白MTH2和MTH3在快速老化小鼠SAMP8胸腺中的表达,探讨其与SAMP8增龄性变化的相关性。方法选用1、4、8、12月龄的SAMP8小鼠及同龄的抗快速老化小鼠R1(SAMR1)作为实验对象。采用免疫印迹法检测胸腺中MTH2和MTH3蛋白的表达。结果免疫印迹结果显示,在SAM鼠胸腺中MTH3蛋白的表达量均显著高于MTH2。定量结果显示,1、4、8、12月龄的SAMP8胸腺中MTH3表达的灰度值(grey level)分别为0.546、0.322、0.207、0.164,显著低于同龄SAMR1(P<0.05),而MTH2在SAMP8和SAMR1胸腺中的表达却没有显著性差异(P>0.05)。与同组1月龄小鼠相比,MTH3在4、8、12月龄的SAMP8鼠胸腺中的表达量分别下降41%、62%、70%;在SAMR1鼠中分别下降19%、43%、67%,差异有统计学意义(P<0.05)。而MTH2在SAMP8和SAMR1胸腺中的表达也存在相同的增龄性下降的变化趋势(P<0.05)。结论MTH2和MTH3蛋白在SAMP8和SAMR1小鼠胸腺中的表达量均呈增龄性下降,提示MTH2和MTH3蛋白表达量的减少在SAM鼠胸腺的衰老过程中具有重要意义,其中MTH3蛋白表达量的减少可能与SAMP8小鼠胸腺的快速衰老密切相关。

细胞色素P450 2C9药物代谢酶体外酶学活性检测新方法的建立

目的建立一种基于COS-7细胞的细胞色素P450 2C9(CYP2C9)体外酶学活性检测的新方法。方法以野生型CYP2C9*1基因的全长cDNA为模板,通过定点诱变方法获得突变型CYP2C9*2、*3及*13的cDNA全长,分别与分泌型荧光素酶Gluc内参基因一起导入pIRES载体的A、B多克隆位点,构建成双表达载体pIRES-Gluc-CYP2C9。利用Lipofectamine 2000瞬时转染COS-7细胞,48h后弃培养基,加入含100μmol/L Luciferin-H荧光底物的新鲜培养基,继续培养8h后利用Promega CYP2C9活性试剂盒及NEB Gluc检测试剂盒分别检测CYP2C9各型及内参Gluc的活性,用Western blot检测两种蛋白的表达量。结果本研究成功构建了pIRES-Gluc-CYP2C9*1及其突变体*2、*3、*13的表达载体,通过检测CYP2C9特异性荧光素底物Luciferin-H的分解产物的荧光信号与分泌型荧光素酶Gluc的内参荧光信号的比值作为CYP2C9的体外酶学活性值,研究结果显示突变体CYP2C9*2、*3、*13的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的43.12%、8.15%和1.49%。结论本研究成功建立了一种基于COS-7细胞的CYP2C9体外酶学活性检测的新方法,该方法操作简便、实验周期短,适于新突变体CYP2C9的快速活性检测及其代谢新药物或抑制剂的相关性研究。

MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性

目的探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性。方法PCR法扩增富含组氨酸钙结合蛋白（histidine—rich calcium—binding protein，HRC）基因启动子／增强子序列，插入报告载体pGL3-Basic中，生成pGL3-HRC enhancer质粒，该质粒与全长野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA—MEFcDNA，或含4～15个CAG的变异型MEF2AcDNA表达质粒pCDNA—MEFcDNA—CAGr，以及内参质粒pRL—TK，用脂质体转染法共转染于293T细胞，Western blot检测MEF2A蛋白的表达，双荧光素酶检测系统测定报告分子的表达。结果成功构建了MEF2A蛋白体外转录激活活性检测系统；所构建的含4～15个CAG序列的MEF2A变异蛋白，与含11个CAG序列的野生型MEF2A蛋白之间其转录激活活性没有显著性差异。结论目前已发现的MEF2A第11号外显子CAG重复数目的改变不会影响MEF2A蛋白的转录激活活性。

低剂量饮酒抑制大鼠肝组织DNA中8-oxo-dGsn水平

目的检测低剂量饮酒大鼠肝组织DNA中氧化标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-dGsn)水平,评价低剂量饮酒对肝脏组织氧化应激的影响。方法 4月龄的健康雄性SD大鼠48只,随机分为对照组和饮酒组,饮酒组每天灌胃56度二锅头酒每天每公斤低于2g(<2g/kg),对照组每天灌胃同等体积的生理盐水。在灌胃4、8、12周时,用放射性核素稀释高效液相-串联质谱(ID-LC-MS/MS)方法检测大鼠肝组织DNA中氧化标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-dGsn)含量;用分光光度法测定抗超氧阴离子(O2-)能力和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力。结果低剂量饮酒4、8、12周后的肝组织DNA中8-oxo-dGsn含量均较同时间点对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量饮酒4、8、12周后的肝组织中抗O2-能力与GSH-PX活性均增强,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论低剂量饮酒可抑制大鼠肝组织DNA中的氧化水平,可能与肝脏中抗氧化酶活性的增高有关。

ID-LC-MS/MS方法对被动吸烟大鼠肺组织DNA中8-oxo-dGsn的检测

目的用同位素稀释高效液相-串联质谱(ID-LC-MS/MS)方法检测大鼠肺组织中DNA氧化标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-dGsn)含量,评价长期被动吸烟的大鼠肺组织DNA的氧化损伤程度。方法健康雄性SD(Sprague-Dawleyrats)大鼠20只,随机分为4组:被动吸烟1个月模型组(Smoke-1M组)及其对照组(Control-1M组),被动吸烟4个月模型组(Smoke-4M组)及其对照组(Control-4M组)。被动吸烟组每次烟熏1h,每天2次,每次用烟5支。被动吸烟1个月、4个月后,分别取大鼠肺组织检测其DNA中的8-oxo-dGsn含量。结果被动吸烟1个月后,大鼠肺组织DNA中8-oxo-dGsn含量高于其正常对照组(P<0.05);被动吸烟4个月后,肺组织DNA中8-oxo-dGsn含量比正常对照组增加显著(P<0.01)。结论被动吸烟1个月即可造成大鼠肺组织DNA的氧化损伤,被动吸烟大鼠肺组织中DNA氧化损伤程度随烟龄增长有积累趋势,被动吸烟是肺组织中DNA氧化损伤的重要原因。