产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系的临床应用前研究

目的:探讨产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的意义,为该检测体系的临床应用提供可靠的技术依据。方法:将已知浓度霍乱弧菌灭活菌株悬液连续10倍稀释后与新鲜健康成人粪便混匀;制备成含菌量为5.0×101CFU/g^5.0×109CFU/g梯度浓度的模拟带O1群霍乱弧菌者粪便标本和含菌量为5.0×101CFU/g^5.0×108CFU/g梯度浓度的模拟带O139群霍乱弧菌者粪便标本;用以评价我们自主建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的敏感度、特异性和稳定性。结果:该实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌或O139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度均为1.0×103CFU每反应体系,亦相当于模拟带菌者粪便标本5.0×104CFU/g;对不同含菌量的模拟带菌者粪便标本的3次重复实验结果显示,各靶序列扩增反应Ct值的检测变异系数均小于5%;对新鲜健康成人粪便标本的检测未见明确的异常扩增。结论:我们建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系可作为O1群或O139群产毒型霍乱弧菌临床粪便标本敏感、特异和稳定的检测手段。

产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链反应检测体系的临床应用前研究

目的：探讨产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系对临床模拟标本检测的意义,为该检测体系的临床应用提供可靠的技术依据。方法：将O139群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0×10^10cfu（菌落形成单位）/ml]连续10倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0×10^1 - 5.0×10^8cfu/g梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价我们自行建立的产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系对临床模拟标本检测的敏感度、特异性和稳定性。结果：实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系对O139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度为1.0×10^3cfu每反应体系（5.0×10^4cfu/g）,其线性检测范围是1.0×10^3-1.0×10^7cfu每反应体系;在稳定性评价中,对1.0×10^3-1.0×10^7cfu模拟带菌者粪便标本DNA进行3次重复检测的结果显示,ctxA基因扩增反应Ct值的变异系数为1.40%-4.10%,rfb-O139基因扩增反应Ct值的变异系数为0.04%-2.08%;在特异性评价中,3名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线。结论：我们建立的产毒型O139群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应检测体系可用于O139群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。