乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。

人羊水祖细胞的分离和基因修饰

探讨从孕中期羊水中分离出人羊水祖细胞的有效方法和FIX基因修饰后的效果,为血友病B的产前治疗提供可行的基础。从镜下分离出呈致密克隆生长的梭形细胞集落,经培养传代后,通过第3代慢病毒载体将hFIX导入该细胞,经酶联免疫反应(ELISA)等方法检测hFIX的表达并检测凝血活性。用这种方法得到的羊水祖细胞呈成纤维细胞样,倍增时间为39.05 h,该细胞在不仅在蛋白水平表达干细胞表面分子SSEA4,TRA1-60,在基因水平还可检测到NANOG,OCT4,SOX2mRNA的表达。羊水祖细胞导入hFIX cDNA后,能合成并分泌hFIX蛋白,传代后48 h在上清液中的浓度为20.37%±2.77%,凝血活性16.42%±1.78%。上清液中的浓度在第4天达到平台期,为50.35%±5.42%,凝血活性可达45.34%±4.67%。ELISA检测显示转染后的羊水细胞表达的hFIX蛋白的水平呈现基本稳定趋势,波动幅度较小;同时检测FIX凝血活性也与蛋白浓度呈正相关。从羊水中可以分离得到具有多能性祖细胞,转染了hFIX的羊水祖细胞在体外能持续合成有凝血功能的hFIX蛋白,为血友病B产前治疗的新方法提供了实验依据。

用诱导性多能干细胞进行临床治疗的安全考量

诱导性多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)具有高度相似性。在理论上,iPSCs避免了ESCs无法回避的免疫排斥和伦理问题,为再生医学提供重要的细胞资源,具有广阔的临床治疗前景。然而,为实现其在临床上的应用,还须克服诸多问题,如已发现iPSCs具有潜在的致瘤性和免疫原性,以及iPSCs在重编程和传代培养过程中发生基因组变异和表观遗传改变的可能性等。就iPSCs临床应用所面临的主要问题进行总结并探讨可能的解决方法。