先天畸形的胚胎早期诊断与治疗新进展

出生缺陷是指出生前已经存在、出生时或生后数年内可以发现的结构或功能异常的疾病,严重的出生缺陷可在生命早期即致死或致残,是导致早期流产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡和先天残疾的主要原因,而且其发生率呈现逐年上升的趋势[1-2]。目前,我国每年新增80万~120万例出生缺陷患儿,是出生缺陷的高发国家[3]。我国现有8 000万以上的残疾人,其中70%是由于出生缺陷所致,给社会和家庭带来巨大的精神和经济负担。尤其是随着国家二孩政策的全面放开,高龄、高危产妇数量迅速增加,发育畸形的发生率也随之上升[4]。在所有出生缺陷病例中,约80%为具有明显结构异常的先天畸形。

先天性肛门直肠畸形病因学研究新进展

先天性肛门直肠畸形（congenital anorectal malformation,ARM）是最常见的消化道畸形之一,其全球范围内发生率为0.2‰~0.6‰,男性发病率略高于女性[1,2]。ARM是后肠在胚胎4~8周发育异常所致的一组不同表型的肠道畸形,从简单的直肠会阴瘘等低位畸形到复杂的一穴肛、直肠膀胱瘘等高位畸形,畸形的类型不同所采用的手术术式也不同,其治疗效果也不同,肛门狭窄、

先天性巨结肠Pax3和Cx43基因突变及表达

目的:探讨Pax3(pairedbox3)和Cx43(connexin43)基因在先天性巨结肠(Hirschsprungs disease,HD)中突变及表达的意义,分析HD与Pax3和Cx43基因异常的关系. 方法:应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和银染单链构像多态性(SSCP)方法检测Pax3和Cx43基因突变和mRNA表达情况. 结果:正常人38例肠段对照组织中DNA未发现Cx43 SSCP 异常泳动带,而仅有3例(7.9%)出现Pax3 PCR产物单链异常泳动带;HD38例肠管组织中17例(44.7%)出现Pax3 PCR产物单链异常泳动带,11例(28.9%)出现Cx43 PCR 产物单链异常泳动带.HD各段肠管组织中均有Pax3基因mRNA的表达,痉挛段、移行段和扩张段肠管组织中Pax3 mRNA高表达,表达率分别为92.1%,86.8%和76.3% (mean±SD=1.63±0.37;1.42±0.41和1.25±0.17);而正常肠段组织中Pax3 mRNA无表达,有显著性差异(aP<0.05).Cx43 基因mRNA在痉挛段、移行段肠管组织中低表达,表达率为23.7%和18.4%(mean±SD=0.62±0.11和0.51±0.07);而扩张段肠管组织中Cx43有较高表达,表达率为55.3% (mean±SD=1.37±0.19).38名正常人肠段对照组织中无1例Cx43 mRNA阳性表达. 结论:HD组织中Pax3和Cx43基因突变及表达异常可能与HD的发生相关密切,Pax3和Cx43突变可能造成信息传递缺陷,扰乱了神经嵴细胞的迁移,从而导致HD的发生.

Notch-1及Jagged-2基因在肛门直肠畸形大鼠直肠发育过程中的表达及意义

目的检测Notch-1及Jagged-2基因在肛门直肠畸形(ARM)胎鼠直肠肠壁的胚胎发育过程中的表达变化,探讨其与肠壁神经肌肉发育的关系。方法应用免疫组化和Western blot方法检测正常与乙烯硫脲致畸的ARM胎鼠直肠末端组织Notch-1及Jagged-2蛋白的定位及定量表达,应用RT-PCR方法检测Notch-1及Jagged-2基因mRNA的表达差异。结果 Notch-1/Jagged-2在正常大鼠胚胎直肠发育过程中,在肠壁肌间神经丛(MP)、肠壁平滑肌及黏膜层均有表达,随着胚胎发育,表达强度逐渐增强,胚胎晚期主要集中在肠壁平滑肌及神经丛处;ARM组E17～E21表达均较正常组减弱,E19～E21表达与正常组差异更为显著。正常胎鼠直肠末端壁内中Notch-1及Jagged-2总蛋白量及mRNA明显高于畸形组(P<0.05)。结论 Notch-1/Jagged-2基因在肛门直肠畸形的神经肌肉发育过程中表达下调,可能与其发育不良有一定关系。

Cajal间质细胞及突触素在肛门直肠畸形动物模型末端直肠壁的表达及意义

目的检测Cajal间质细胞(ICCs)及突触素(SY)在肛门直肠畸形胎鼠直肠肠壁的胚胎发育过程,探讨其表达的意义。方法应用免疫组化、免疫荧光和Western blot方法检测正常与肛门直肠畸形胎鼠直肠末端组织c-kit、SY的表达情况。结果正常组结肠及直肠壁内肠壁肌层及黏膜肌层c-kit、SY大量表达;畸形组胎鼠直肠末端壁内的分布均比对照组明显减少,发育延迟,但随着远离盲端,c-kit、SY出现并逐渐增多。正常胎鼠直肠末端壁内c-kit、SY总蛋白量明显高于畸形组(P<0.05)。结论Cajal间质细胞及突触素的分布异常是肛门直肠畸形动物模型直肠末端壁的重要病理改变之一。

先天性巨结肠组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的分析先天性巨结肠(HD)狭窄段及正常段肠管组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法采用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分离20例HD患者配对狭窄段及正常段肠管组织的总蛋白,银染显色,Image Master 2D Platinum 6.0软件分析差异表达的蛋白质点。结果获得了重复性较好的2-DE银染图谱。图像分析显示,狭窄段和正常段肠管组织凝胶的平均匹配率分别为78.1%和86.7%。差异分析共获得103个差异表达的蛋白质点。结论采用2-DE分离HD肠管组织的总蛋白可获得重复性较好的结果。获得的差异蛋白质点为寻找HD早期诊断的分子标记物提供了基础资料。

COLIA1调控小鼠神经细胞迁移在神经管畸形中的作用

目的探讨Ⅰ型胶原蛋白α1(COLIA1)调控神经细胞迁移活动对小鼠神经管闭合的作用。方法利用全反式维甲酸(ATRA)诱导建立神经管畸形(NTDs)小鼠模型。采用Western blotting检测COLIA1,上皮细胞间质转化(EMT)相关指标E-cadherin、Snail、Vimentin表达情况。在C17.2神经干细胞中沉默COLIA1后,Western blotting检测COLIA1对E-cadherin、Snail和Vimentin表达的调节作用,通过Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验观察细胞迁移生物学活动变化。结果在ATRA诱导的NTDs小鼠模型中,COLIA1表达下调,迁移相关的EMT指标Snail、Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调。在C17.2神经干细胞中,沉默COLIA1表达后,EMT指标Snail、Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调,细胞迁移能力降低。结论COLIA1通过影响细胞迁移抑制NTDs的形成。

利用同位素标记相对和绝对定量技术筛查神经管畸形胚胎孕鼠血清差异蛋白质谱

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,定量信息以蛋白的丰度比差异倍数1.5倍以上(P <0.05)为差异蛋白质。结果质谱共得到谱图157 422张,鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种。结论筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展。

胎儿先天性心脏病无创性产前筛查分子标志物的研究进展

先天性心脏病(congenital heart defects,CHD)是目前最常见的先天缺陷,发生率为(6~8)/1000,占婴儿先天性疾病死亡率的30%~50%[1-2]。尽管CHD发病机制方面的相关研究较多,但其病因仍不清楚,仍然是一个严重的问题。因此,早期产前诊断对于改善母亲和胎儿双方结局是至关重要的,在某些类型的胎儿心脏异常中,早期产前诊断有助于提供最佳的围产期和围术期管理,减少产后发病率和死亡率[3]。在当前的围产保健中,CHD的临床诊断主要依靠妊娠中期的胎儿超声心动图检查。

神经管畸形发病机制研究进展与新策略

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是由于胚胎发育早期神经管闭合异常所致,是最常见、最严重的中枢神经系统先天性畸形。全球范围内发生率为0.55‰~21‰[1],不同国家和地区发生率有所不同,我国北方是NTDs的高发地区。近年来,随着孕期保健知识的普及和叶酸补充的加强,NTDs的发生率有了明显降低[2-3]。但仅仅依靠补充叶酸只能预防30%~50%NTDs的发生[4]。NTDs目前仍然是常见的先天畸形之一,发生率仅次于先天性心脏病。

生物标志物在神经管畸形产前诊断方面的进展及应用

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种严重的小儿神经系统先天畸形,据报道2015年全球NTDs患病率为1.86‰,世界不同地区的NTDs患病率为0.75‰~3.12‰[1]。该病于妊娠早期21~28 d发生,因神经皱襞在中线融合失败,神经管未闭合所致,是最常见和致残率最高的出生缺陷之一[2]。根据中枢神经组织是否暴露于外部环境,可将神经管缺陷划分为两种类型,即开放性和闭合性缺陷;根据神经管闭合失败的解剖部位,开放性缺陷又可分为颅轴裂、前脑无脑和脊髓脊膜膨出,闭合性缺陷又可分为脑膨出、脊膜膨出和隐性脊柱裂[3]。

小儿急性白血病外周血中单个核细胞IL-8及受体mRNA表达的研究

目的:单个核细胞白细胞介素-8(IL-8)及其受体(IL-8R)基因mRNA在小儿急性白血病(CAL)的表达。方法:应用RT-PCR技术对CAL的外周血做IL-8及IL-8R mRNA检测。结果:CALIL-8及IL-8R水平均显著高于正常人。初发CAL IL-8 mRNA 78.13％;化疗后CAL mRNA 31.58％表达。初发CAL IL-8R mRNA 84.36％表达;化疗后mRNA36.84％表达。结论:IL-8及IL-8R基因mRNA在CAL的初发中有明显表达,在化疗后表达不明显。

nNOS和iNOS在神经管畸形胎鼠大脑皮质中的表达及意义

目的研究乙烯硫脲(ETU)致神经管畸形胎鼠大脑皮质中nNOS和iNOS表达情况,进一步探讨nNOS和iNOS在脑发育中的作用。方法应用免疫荧光、Western-blot及Real-time PCR方法检测nNOS和iNOS在正常胎鼠、ETU致畸的神经管畸形胎鼠的大脑皮质表达情况并进行定位、定量分析。结果nNOS在给药无畸形组、脊柱裂畸形组胎鼠大脑皮质中的表达与正常对照组相比无明显差异(p>0.05),而在脑膜膨出组胎鼠大脑皮质中nNOS的表达与正常对照组明显减少(p<0.01);iNOS在各组均未检测到。结论nNOS在脑膨出的胎鼠大脑皮质中表达明显减少,提示nNOS参与了脑异常发育过程。

白细胞介素-8及其受体在小儿急性白血病骨髓单个核细胞中的表达和临床意义

目的探讨白细胞介素8(IL8)及受体(IL8R)在小儿急性白血病骨髓单个核细胞中的表达和临床意义。方法RTPCR法检测32例急性白血病骨髓单个核细胞IL8,IL8RmRNA表达。结果急性髓系白血病(AML)组中有5例表达IL8(5/10),4例表达IL8R(4/10);急性淋巴细胞白血病(ALL)组中有13例表达IL8(13/22),9例表达IL8R(9/22)。IL8在急性髓系白血病组中的表达水平高于急性淋巴细胞白血病组,差异有显著性(P<0.05)。AML组中M4M5亚型中的表达水平高于M2M3,差异有显著性(P<0.05)。ALL组中B系列ALL表达水平高于TALL,差异有显著性(P<0.05)。化疗后患儿骨髓单个核细胞IL8,IL8R水平显著低于化疗前(P<0.05)。结论小儿急性白血病有IL8,IL8R的表达,IL8尤其在AML组M4M5亚型及B系列ALL更明显,化疗后两者水平显著下降。

小鼠跨胎盘RNA干扰EphB2基因在先天畸形中的实验研究

目的应用跨胎盘RNA干扰技术抑制胚胎鼠EphB2基因，探索研究易感基因在先天性畸形中的作用。方法构建先天性肛门直肠畸形（anorectal malformation，ARM）相关易感基因EphB2下调质粒SiEphB2，设计3个不同位点SiEphB2，通过鼠尾静脉向孕鼠注射SiEphB2质粒，空载体及Ringer’s液。孕鼠在孕9．5d注射，48h后取出胚胎，应用实时定量PCR及Western blotting检测EphB2基因在子代鼠的mRNA和蛋白质表达水平。并观察新生鼠的肛门直肠发育情况。结果在mRNATk平，发现SiEphB2载体注射组（SiEphB2组）EphB2基因表达比较空载体注射组（Vector组）及释液注射组（Ringer’s组）明显降低。Ringer’s组均值为0．99±0．06，Vector组为0．87±0．07；SiEphB2组中，SiEphB2—1组均值为0．27±0．03，SiEphB2—2组为0．34±0．04，SiEphB2—3组为0．42±0．02。SiEphB2组胚胎EphB2基因较Ringer’S组和Vector组分别下调（65．3±6．6）％和（60．6±8．6）％，差异有统计学意义（P〈O．05）。在蛋白质水平，Ringer’s组为1．00±0．05，Vector组为0．93±0．09；SiEphB2组中，SiEphB2—1组为0．20±0．03；SiEphB2—2组为0．33±0．02；SiEphB2—3组为0．39±0．02。SiEphB2组胚胎EphB2基因较Ringer’s组和Vector组分别下调（69．3±7．8）％和（66．9±9．6）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。大体观察SiEphB2组胎鼠可见肛门及鼠尾发育，矢状位切片HE染色未见ARM发生。结论胚胎鼠早期跨胎盘RNA干扰是研究基因功能现实可行的研究方法，跨胎盘SiEphB2可下调子代鼠基因。

神经干细胞增殖在小儿先天神经管畸形发生发展中的作用

神经管畸形(neural tube defects,NTD),是一种严重的先天畸形,发病率约1/1000,在我国NTD的平均发病率为1.295/1000[1]。近年来在发达国家发病率有改善,但在拉丁美洲、非洲、中东等地区发病率仍居高不下,在1/1000~11/1000之间[2]。

组织工程技术在开放性脊柱裂产前治疗中的应用

开放性脊柱裂(spina bifida operta,SBA)是一种严重的中枢神经系统先天畸形,由胚胎发育过程中神经管不完全闭合而引起,是最常见的神经管畸形表型之一[1],世界范围内人群发生率为1‰~10‰[2]。SBA患者易患后脑疝,经常伴有脑积水、下肢运动障碍、尿便失禁等一系列并发症,需要终身康复治疗.

miR-92a-3p在小鼠胚胎神经管闭合中的作用及机制

目的探讨miR-92a-3p与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)之间的相互作用,以及两者在神经管畸形(neural tube defect,NTD)中对细胞迁移的影响。方法实验动物采用C57BL/6J小鼠,孕鼠随机分为NTD组与对照组,每组30只,NTD组采用全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导NTD模型,于E9.5采集胚胎样本。实验所用细胞系为小鼠神经干细胞C17.2,转染NOX4过表达质粒、miR-92a-3p模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测胚胎和C17.2细胞中miR-92a-3p表达,采用蛋白质印迹法检测NOX4的表达。通过双荧光素酶报告基因实验明确miR-92a-3p对NOX4的结合及靶向调控关系。采用细胞划痕实验与Transwell实验观察miR-92a-3p和NOX4对细胞迁移活动的影响。统计学方法采用单因素方差分析、独立样本t检验。结果NTD组胚胎miR-92a-3p表达低于对照组(0.753±0.052与1.006±0.126,t=3.212,P=0.033),NOX4蛋白表达高于对照组(0.870±0.039与0.688±0.056,t=4.621,P=0.010)。在转染NOX43’端非翻译区(3’untranslated regions,3’UTR)荧光素酶报告基因的C17.2细胞中,共转染miR-92a-3p模拟物组的荧光素酶活性低于模拟物对照组(0.368±0.102与1.000±0.149,t=5.530,P=0.005);共转染miR-92a-3p抑制剂组的荧光素酶活性高于抑制剂对照组(1.254±0.080与1.000±0.129,t=2.899,P=0.044)。C17.2细胞转染miR-92a-3p模拟物组,NOX4的蛋白表达低于模拟物对照组(1.077±0.142与1.432±0.300,t=2.396,P=0.044);转染miR-92a-3p抑制剂组,NOX4的蛋白表达高于抑制剂对照组(1.443±0.054与1.249±0.090,t=3.709,P=0.010)。细胞划痕的实验结果表明,转染NOX4质粒后,细胞伤口愈合的速度低于对照组[(8.8±6.5)%与(44.1±6.8)%,t=6.513,P=0.003],然而当过表达NOX4的同时转染miR-92a-3p,与转染NOX4组比较,细胞伤口愈合速度加快[(37.2±11.7)%与(8.8±6.5)%,t=3.680,P=0.021]。Transwell实验发现,转染NOX4质粒后,迁移的细胞数量低于对照组[(102.7±4.5)与(133.0±11.8)个,t=4.162,P=0.014],而共转染NOX4与miR-92a-3p后,与转染NOX4组比较,发生迁移的细胞明显增多[(176.0±11.0)与(102.7±4.5)个,t=10.680,P<0.001]。结论小鼠NTD模型中,异常低表达的miR-92a-3p能够通过上调NOX4的表达,阻碍小鼠胚胎神经管闭合过程中细胞的迁移活动,最终导致NTD的发生。

肿瘤转移抑制基因KiSS-1在子宫内膜癌组织中的表达及意义

目的检测KiSS-1mRNA及KiSS-1蛋白metastin在子宫内膜癌组织中的表达,探讨其在子宫内膜癌浸润及转移中的作用。方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法及免疫组织化学(SP)法检测32例子宫内膜癌,10例子宫内膜上皮内瘤样病变(EIN)及12例正常子宫内膜组织中KiSS-1mRNA及KiSS-1蛋白metastin的表达情况及其与各种临床病理参数的关系。结果KiSS-1mRNA在子宫内膜癌组中的表达率(37.5%)明显低于EIN组(80.0%)及正常内膜组(83.3%),并且其在子宫内膜癌组中的表达率与临床分期、肌层浸润深度及淋巴结转移密切相关,均P<0.05。KiSS-1蛋白metastin在子宫内膜癌组中的表达率(43.8%)明显低于EIN组(90.0%)及正常内膜组(91.7%),并且其在子宫内膜癌组中的表达率与临床分期、肌层浸润深度及淋巴结转移密切相关,均P<0.05。KiSS-1mRNA和KiSS-1蛋白metastin在子宫内膜癌组织中的表达具有明显的正相关。结论肿瘤转移抑制基因KiSS-1在抑制子宫内膜癌的浸润和转移过程中可能起着重要的作用。

COL1a1 COL3a1在发育性髋脱位患儿关节囊的表达

目的发育性髋脱位(developmental dislocation of the hip,DDH)的病因目前不明,但其与髋关节松弛密切相关。该研究通过比较DDH患儿与正常儿童关节囊中Ⅰ,Ⅲ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达差异,以探索DDH患儿髋关节松弛的原因。方法选取性别相同年龄相近的9对发育性髋脱位患者及正常儿童配对比较。采用半定量RT-PCR及Western-Blot法检测COL1a1 COL3a1在mRNA及蛋白水平的表达。图像分析软件进行量化分析,并经统计学处理。结果COL1a1在DDH组mRNA及蛋白水平表达均较正常对照组降低(P<0.01);COL3a1在DDH组mRNA水平表达较正常对照组降低(P<0.01),其蛋白水平表达与正常对照组无显著差异(P>0.05)。结论DDH患儿关节囊中Ⅰ型胶原在mRNA及蛋白水平表达较正常同性同龄儿降低,可能是导致DDH患儿髋关节松弛的原因。DDH患儿髋关节松弛可能与Ⅲ型胶原含量无关。