RNA干扰胰岛素样生长因子结合蛋白2基因治疗胶质瘤的体外实验研究

目的研究与胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGF-BP2)对胶质瘤的抑制作用。方法化学合成3条针对IGF-BP2的siRNA和1条阴性对照siRNA,采用小分子干扰RNA技术使胶质瘤U251细胞的IGF-BP2基因沉默。通过逆转录PCR和免疫组化的方法检测IGF-BP2的表达,用MTT法检测干扰后U251细胞的增殖活性变化。结果逆转录PCR检测表明转染后24hIGF-BP2的mRNA表达明显降低,空白对照、阴性对照、脂质体、siRNA1、siRNA2、siRNA3组中IGF-BP2mRNA水平分别为:0.88±0.02,0.87±0.03,0.84±0.02,0.65±0.03,0.55±0.04和0.64±0.02。48h分别为0.93±0.04,0.90±0.04,0.93±0.03,0.76±0.04,0.58±0.03和0.75±0.02,72h为0.95±0.04,0.95±0.03,0.94±0.02,0.78±0.05,0.60±0.02和0.76±0.03。3条siRNA中siRNA2作用最显著。免疫组织化学方法检测表明IGF-BP2的蛋白表达阳性率也由92.3%明显降低至24h的15%,至48h为52.5%,仍低于正常胶质瘤细胞。RNA干扰后胶质瘤细胞的MTT值虽在缓慢升高,于24h相对于对照组差异无统计学意义,但至48h和72h均低于对照组(P<0.05)。结论理想的IGF-BP2小分子干扰RNA序列能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制胶质瘤细胞的增殖活性。

铁过载骨髓造血细胞体外模型的建立及其对造血的影响

本研究通过铁与骨髓单个核细胞共培养,建立铁过载骨髓造血细胞模型并观察其对造血功能的影响。在体外培养骨髓单个核细胞的过程中,在培养液中添加枸橼酸铁铵(FAC),使细胞铁过载,建立铁过载骨髓造血细胞模型,然后检验这一过程中造血细胞的凋亡水平、造血集落形成(CFU-E、CFU-GM、BFU-E和CFU-mix)和CD34+细胞的计数变化。再用去铁胺(DFO)祛铁,观察上述指标的变化。结果发现:在不同时间加入培养液中不同浓度FAC,骨髓造血细胞内可变铁池(LIP)水平升高,且具有时间和浓度依赖性,在含400μmol/L FAC的培养液中培养24小时时LIP水平达到最高。骨髓细胞造血功能检测表明,FAC组细胞凋亡比例(24.8±2.99%)较对照组(8.9±0.96%)显著升高(p(0.01);造血集落形成单位计数明显低于对照组(p(0.05);CD34+细胞比例(0.39±0.07%)与对照组(0.91±0.12%)相比也显著降低(p(0.01)。这些损伤影响可以通过DFO的处理部分消除。结论:在体外培养过程中添加铁能诱导骨髓单个核细胞铁过载,建立铁过载骨髓造血细胞模型,并能引起骨髓造血功能损伤,而这种损伤作用可以通过祛铁法减轻。本模型为深入研究铁过载对骨髓细胞造血功能的作用机制提供实验方法,并为骨髓造血功能低下的铁过载病人治疗提供新的靶点。

类风湿性关节炎细胞水平建模四种方法比较

目的比较四种方法在培养类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞(FLS)中的异同,为研究RA提供较好的体外实验模型建模方法。方法20例滑膜组织标本均用组织块法、单胶原酶消化法、单胰酶温消化法和双酶消化法四种方法分离、培养RA FLS,均取培养第7日细胞计数,取第4代细胞鉴定,免疫组化鉴定细胞,测定分离细胞的数量和纯度。结果四种培养方法的培养时间比较,单胶原酶法>双酶消化法>组织块法>单胰酶法(P<0.05)。组织块法及双酶消化法所得细胞数较单胶原酶法及双酶消化法少(P<0.05)。第4代细胞均以FLS为主(>95%)。结论四种方法体外培养可获得生物学特性稳定的RA FLS细胞系,其中组织块法是细胞水平建立RA体外实验模型成功率较高的方法,单纯胰酶法是较快速的方法。

白血病干/祖细胞相关基因表达在急性白血病中的临床意义

本研究旨在检测白血病干/祖细胞(LSPC)相关基因ABCB1、BMI-1、HOXB4在急性白血病患者骨髓中的表达,并探讨其在急性白血病中的临床意义。采集41例初治急性白血病患者的骨髓、16例缓解期患者的骨髓及10例非恶性血液病患者骨髓标本(作为对照)。采用SYBR Green相对定量RT-PCR法检测ABCB1、BMI-1、HOXB4基因的表达水平,并分析它们与急性白血病疗效、预后的关系。结果表明,ABCB1、BMI-1、HOXB4在对照组均无表达,在初治组相对表达量分别为4.26±2.26、3.72±1.91、3.74±2.38;而在缓解标本组分别为2.14±1.47、2.07±0.99、1.47±0.89,均明显低于初治组(p<0.05);正规化疗2个疗程内能够获得完全/部分缓解的患者的基因相对表达量分别为1.77±1.29、2.09±1.26、1.78±1.49,明显低于未缓解的难治病例(分别为7.23±1.78、3.96±0.92、4.48±2.57)(p<0.01)。单因素分析发现,各个基因高表达患者的白血病干/祖细胞免疫表型(CD34+CD38-CD96+和CD34+CD38-CD123+)表达阳性的比例及出现高白细胞(≥30×109/L)的几率均高于低表达患者,差异显著(p<0.05);而综合分析各个基因的表达,上述变化的p值均小于单因素分析p值,差异更显著(p<0.01)。结论:LSPC相关基因(ABCB1、BMI-1、HOXB4)表达与LSPC免疫表型呈相关性,在急性白血病患者发病初期表达增高,缓解后其表达水平明显下降;表达高者易出现高白细胞,化疗效果差,缓解率低。综合多指标分析可能是一种更好地临床评估疗效和预后的方法。

卡莫司汀-聚乳酸缓释膜片植入家犬脑内的药代动力学研究

目的观察卡莫司汀(BCNU)-聚乳酸(PLA)缓释膜片植入家犬脑内的药代动力学特征及BCNU在脑组织中的浓度。方法制备10%BCNU-PLA缓释膜片,并将其植入12只家犬脑内,术后采集不同时间外周血样并处死家犬采集脑组织,采用高效液相色谱法测定血药浓度和脑组织药物浓度。结果术后22h家犬血中可测到BCNU,35h达到峰值(平均243.64ng/ml)。术后5d脑组织中药物浓度平均26.60μg/g。结论BCNU-PLA缓释膜片是治疗恶性胶质瘤的一个良好剂型。

氧化应激对铁过载造血干祖细胞造血功能的影响

目的 体外诱导脐血来源的造血干祖细胞铁过载,检测参与氧化应激的活性氧物质（ROS）的水平以及对造血干祖细胞造血功能的影响.方法 通过体外培养脐血单个核细胞（MNC）的过程中添加枸橼酸铁铵（FAC）,建立铁过载造血干祖细胞模型.实验分组：对照组、FAC组、FAC＋N-乙酰半胱氨酸（NAC）组、FAC＋谷胱甘肽（GSH）组.检测各组细胞内ROS水平,并用抗氧化剂处理,检验这一过程中ROS、细胞内可变铁池（LIP）、凋亡水平、造血集落形成和脐血各系造血细胞数目的变化.结果（1）在培养液中加入不同浓度FAC（50、100、200、400μmol/L）培养不同时间（6、12、24 h）,发现ROS水平随着FAC的浓度和培养时间变化,且在200μmol/L FAC的培养液中培养24h时ROS水平达到最高.（2）用抗氧化剂（NAC、GSH）联合FAC处理细胞发现,抗氧化剂处理组细胞内总的ROS以及髓系细胞和红系细胞内的ROS明显低于FAC组（均P＜0.05）.（3）在200 μmol/LFAC的浓度下,培养脐血MNC 24 h后细胞内总的LIP、髓系细胞和红系细胞内LIP水平均显著高于对照组（均P＜0.05）,但抗氧化剂NAC和GSH对铁过载细胞内LIP没有明显影响.（4）对脐血造血干祖细胞造血功能的检测发现：FAC组细胞凋亡比例[（20.90±3.45）％]明显高于对照组[（9.20±1.29）％]（P＜0.05）；造血集落形成单位（CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix）计数明显低于对照组（前3项两组间差异具有统计学意义,P ＜0.05）；CD34＋、CD33＋、GlyA＋细胞比例及细胞计数均显著低于对照组（均P＜0.05）；这些损伤都可以通过NAC或GSH处理部分恢复.结论 氧化应激在铁过载造血干祖细胞的损伤中扮演着重要角色,可以通过升高细胞内ROS水平抑制其造血功能,清除细胞内多余的ROS能减轻这些损伤.研究结果可为治疗铁过载患者因氧化应激诱导的造血功能低下提供新的靶点和研究思路.

活性氧介导铁过载对脐带间充质干细胞及其造血支持作用的研究

目的探讨铁过载对脐带间充质干细胞（UC-MSC）的损伤作用及活性氧物质（ROS）在该机制中的意义。方法体外培养UC．MSC，用不同浓度的枸橼酸铁胺（FAC）处理UC-MSC不同时间建立铁过载模型。采用细胞倍增时间计算细胞的增殖能力；用AnnexinV／PI双染法检测细胞的凋亡；用共培养方法检测UC-MSC的造血支持能力；并用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；Western印迹法检测铁过载及抗氧化处理后UC-MSC内ROS相关信号蛋白p-p38MAPK、p38MAPK及1953的表达。结果（1）加铁组UC-MSC的群体倍增时间明显长于对照组[第3代细胞：（24．43±2．72）h比（16．03±2．31）h，P〈0．05]，但传代次数增加2代后两组之间差异无统计学意义（P〉0．05）；（2）加铁组UC-MSC的凋亡率（12．75％±0．32％）明显高于对照组（3．63％±0．80％）（P〈0．05）；（3）脐血单个核细胞（MNC）与加铁组UC-MSC共培养1和2周时，其造血集落形成能力均明显低于对照组（均P〈0．05）；（4）加铁组UC-MSC内ROS水平明显高于对照组，且ROS的水平呈时间与浓度依赖性，在400LLm0L／LFAC浓度下作用12h达到最高值（1499±86比548±97，P〈0．05）；（5）加铁组UC-MSC的p-p38MAPK、P53蛋白表达明显高于对照组，当给予抗氧化剂处理后，相关信号通路可被抑制。结论铁过载可能通过激活ROS相关信号传导因子p-p38MAPK、1953抑制UC-MSC的增殖能力，诱导其凋亡，降低其造血支持能力。

白血病干细胞免疫表型与急性白血病疗效及预后的关系

研究表明，白血病细胞中的CD34＾＋CD38＾-CDl23＾＋亚群［1］和CD34＾＋CD38＾-CD96＾＋亚群［2］同样具备白血病干细胞（LSC）的特性。但是，目前为止，还没有哪个表面标志是公认的LSC特异标志，如何准确界定LSC仍然是研究的难点和热点。LSC表面标志对白血病疗效和预后判断的作用如何？

小肠移植排斥反应对肠道紧密连接蛋白表达的影响

目的 观察大鼠小肠移植排斥反应对肠道紧密连接蛋白表达的影响.方法 建立大鼠异位小肠移植模型,分为3组：假手术组、无排斥反应组和排斥反应组.通过大鼠活动状态及病理评分确定排斥反应程度.采用酶联免疫吸附试验（ELASA）法检测血浆中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2的水平.透射电镜观察肠道紧密连接的超微结构改变.应用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、Westem blot法检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 排斥反应组随时间延长,病理评分增加[3 d：（32.67±2.34）分;5 d：（43.50 ±±2.07）分;7 d：（69.50±2.43）分],肠黏膜屏障功能损伤加重[DAO：3 d：（35.84±5.60）U/ml;5 d：（46.50±O.80） U/ml;7 d：（54.01±1.70） U/ml],TNF-α和IL-2大量释放,肠道紧密连接损伤严重,紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA和蛋白表达水平降低.线性相关分析发现,病理评分、TNF-α、IL-2与紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达呈负相关（P＜0.01）.结论 大鼠小肠移植排斥反应可使肠道功能受损、紧密连接断裂、紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平降低,且其蛋白表达水平与排斥反应程度呈负相关.

诱导C57鼠获得抗β淀粉样蛋白抗体的新途径

目的探讨诱导C57鼠产生β淀粉样蛋白抗体的新途径。方法收获小鼠骨髓细胞,定向培养为树突状细胞(DCs),培养期间加用突变型β淀粉样蛋白1-42多肽刺激致敏。流式细胞仪测定收获的DCs成熟度。将致敏DCs作为疫苗接种至C57鼠,以β淀粉样蛋白+氟氏佐剂接种作为阳性对照,用间接ELISA法测定小鼠的抗β淀粉样蛋白抗体滴度。结果用突变型β淀粉样蛋白刺激DCs可促进其表面CD11c、CD86、MHC-Ⅱ及CD80分子表达从54.69%、76.68%、44.77%和58.65%分别提高到77.49%、92.76%、85.52%和75.57%。接种DCs后14d抗β淀粉样蛋白抗体滴度开始逐渐升高,一直持续到免疫后35d仍未见降低。相对于佐剂疫苗7d显著升高、21d达峰的变化曲线有所平缓和滞后。DCs疫苗免疫后平均抗体滴度最高达到2425.17倍,但比佐剂疫苗组要低(平均最高3200倍)。结论采用DCs疫苗能有效地诱导C57鼠产生足够的抗β淀粉样蛋白抗体。

PNA介导的多肽二聚体形成研究（英文）

介绍了一种由PNA介导的非共价键结合的多肽2聚体形成的新方法.将多肽分别与互补的2条PNA链相连,互补的PNA链在杂交后将使其相连的多肽相互靠近从形成2聚体行驶功能,而使用的平行互补PNA-多肽链很容易通过化学连接方法获得.这项工作指出,PNA作为模板介导生物大分子组装和生物化学反应的潜力.