τ干扰素的结构功能与生物学活性

τ干扰素(interferontau,IFN-τ)作为新发现的一种干扰素,最初发现的作用是反刍动物母体妊娠识别孕体的信号,有抗黄体溶解作用。以后的研究证实,τ干扰素是属于Ⅰ型干扰素,具有抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等作用,并且具有较其他干扰素低的细胞毒性。由于τ干扰素的这些特点,为许多疾病的治疗带来新的希望。

干扰素-τ的研究进展

了解干扰素-(τinterferon tau,IFN-τ)研究现状。综述了近五年来干扰素-τ研究进展。干扰素-τ具有Ⅰ型干扰素的共同特性:具有抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等功能。但IFN-τ在生物学功能方面有自身特点,它仅在胚胎滋养层细胞中表达,无需病毒诱导;另外,高浓度IFN-τ表现出较其他Ⅰ型干扰素较小的细胞毒性。IFN-τ作为一种新的Ⅰ型干扰素,它具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等生物学功能,特别是对反转录病毒抑制的高度特异性以及对自身免疫性疾病的免疫调节活性,且低细胞毒性这一特点,它将成为新型的分子药物。

转基因枸杞中蛋白酶体糜蛋白酶样活性的研究

利用提取的转基因枸杞和正常枸杞蛋白与蛋白酶体的特异性荧光底物Suc-LLVY-AMC室温孵育,于360nm(激发光)/460nm(发射光)波长下测定荧光值的方法,研究了转基因枸杞和正常枸杞中蛋白酶体糜蛋白酶活性的差异及其特异性抑制剂MG115对枸杞中蛋白酶体活性的影响。结果表明表达H IV壳体蛋白的转基因枸杞蛋白酶体活性是空载体对照转基因枸杞蛋白酶体活性的3.6倍,是正常枸杞的4.2倍。10μM的MG115对表达H IV壳体蛋白的转基因枸杞蛋白酶体活性抑制率为87%,携带空载体对照的转基因枸杞抑制率为74%,而对正常枸杞抑制率仅为8.6%;50μM的MG115抑制作用与10μM的相比没有明显变化。这一结果将为利用蛋白酶体抑制剂提高转基因枸杞悬浮细胞H IV-1CA含量的研究提供理论依据。

细胞实验中细胞生长及换液处理对实验结果的影响

利用所设计的核酶抑制转染了HBV的HEPG2细胞内病毒的复制,对所产生的病毒抗原的量进行统计学处理,从而观察到细胞生长和细胞培养液换液对结果的影响。结果表明,换液处理组与未换液处理组的抑制率不同;在96h,未经换液的孔抑制率出现了负值。细胞在80h后数目减少,镜检显示细胞状态不佳。应用细胞生长曲线和细胞换液处理对于实验结果有一定的修正作用。

重组HIV-1壳体蛋白在转基因枸杞根系中的分泌表达

P24壳体蛋白(capsid,CA)是HIV-1早期感染的一个重要标志。用含有植物表达载体pCAMBIA1305.2-MA4-CA(包含GRP信号肽和MA4-CA融合基因)的农杆菌菌株侵染枸杞,将转有MA4-CA融合基因的转化株诱导生根,并进行毛状根的培养;Westernblot证实根系及培养液中的MA4-CA融合蛋白以两种形式存在,分别为37kDa和50kDa左右,前者可能为糖基化形式的单体,后者为二聚体;免疫组织化学显示,CA定位在细胞浆、细胞壁和细胞间隙中,充分证实了利用GRP信号肽可以引导重组蛋白分泌表达。建立枸杞中HIV-1壳体蛋白的根分泌表达系统,为研究植物HIV-1CA-病毒样颗粒(VLPs)疫苗奠定基础。

壳聚糖-海藻酸钠微囊对干扰素-tau的控释作用

目的用壳聚糖和海藻酸钠为原料,制备干扰素-tau微囊,希望开发成为一种口服干扰素制剂。方法使用注射器手工滴制的方法,在滴加过程中,速度和距离是影响囊形的主要因素。结果壳聚糖-海藻酸钠微囊法应用于干扰素-tau药物的包封,其制备简单快速,干扰素-tau包封率很高,并且具有肠溶缓释作用。结论壳聚糖-海藻酸钠微囊有望用作干扰素-tau或其它肽类药物的口服制剂。

干扰素-tau的原核表达、纯化和活性测定

干扰素-tau(IFN-tau)是一种新发现的I型干扰素,为了更清楚地研究它的生物学功能,在已克隆IFN-tau cDNA的基础上,PCR扩增出IFN-tau ORF,与原核表达载体pBV220重组后,成功地构建了IFN-tau的原核表达质粒pBV220/IFN-tau。重组质粒转化大肠杆菌BL21,该菌经过诱导,用凝胶过滤色谱层析的方法获得了纯化的目的蛋白,该蛋白经过氨基酸序列分析证实是IFN-tau;用细胞病变抑制法测定IFN-tau经过透析复性后的活性为2.09×106IU/ml,比活性为2.35×106IU/mg。

HIV-1壳体蛋白的结构及其病毒样颗粒疫苗

人类免疫缺陷病毒 (HIV)的壳体蛋白 (CA)在HIV病毒的组装和成熟过程中起着至关重要的作用。近年来 ,壳体蛋白的体外表达及其疫苗的研制成了HIV各项研究的焦点。由于壳体蛋白具有较好的的保守性 ,用其制得的疫苗也会提供比包膜蛋白更为广泛的免疫保护力。另外若将CA在体外表达成一个颗粒状结构 ,会增强其免疫原性 ,可以使疫苗发挥出更大的效力。

转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA4-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA4-CA融合基因,构建了含MA4-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA4-CA。

HIV-1衣壳蛋白在转基因枸杞中表达的免疫组织化学定位

目的:研究转基因植物中重组蛋白的细胞定位,有助于进一步了解转基因枸杞中HIV-1衣壳(CA)蛋白融合蛋白的分泌表达途径。方法:利用含有MA4-CA融合基因的农杆菌转化枸杞,转化植株获得再生。采用免疫组织化学方法对转基因枸杞表达的CA融合蛋白进行初步定位。结果:免疫组织化学定位表明,在转基因枸杞愈伤组织中,HIV-1CA主要在细胞浆、细胞壁和细胞间隙中表达。结论:免疫组织化学结果初步证明了CA融合蛋白在转基因枸杞中的表达分布。

HSV-1 stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体,并进行序列分析。方法PCR扩增HSV-1-gG基因的膜外区,克隆于pGEM-T载体,转化DH5α,提取质粒酶切鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,鉴定后转化GS115菌,构建酵母表达载体。对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性、抗原性及表达形式。结果获得的重组酵母表达载体pPIC9K-gG,测序结果证实为HSV-1-gG基因,序列分析其高度保守,预测蛋白相对分子质量15870,等电点pI为4.72,包含全部膜外区分值达1.7的6个强抗原决定簇,将以可溶性形式分泌表达于胞外。结论已成功构建HSV-1stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体。

重组干扰素-tau在大肠杆菌中的高效表达

目的研究重组干扰素-tau的纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV220转化E.coli BL21,发酵培养后迅速升温至42℃诱导干扰素-tau以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用8mol/L尿素溶解目的蛋白质,经凝胶过滤色谱层析纯化后,再透析复性。结果干扰素-tau的表达量占菌体总蛋白质量的20%以上,纯化后纯度可达9 6%以上,活性得到有效恢复。结论建立了干扰素-tau纯化及复性的方法,获得了高表达、高纯度、有活性的干扰素-tau。

重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体,包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因,克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中,用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞,用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73 bp,与预期值一致。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒,对HBV的抑制率最高可达61.56%。结论:成功构建重组逆转录病毒载体,在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒,能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制,为HBV的基因治疗提供了实验数据。

用壳聚糖/海藻酸钠制备干扰素-τ缓释微囊

目的:用壳聚糖和海藻酸钠为原料,制备干扰素-τ微囊,希望发展一种口服干扰素制剂。方法:使用注射器手工滴制的方法,在滴加过程中,速度和距离是影响囊形的主要因素。结果:壳聚糖/海藻酸钠微囊法应用于干扰素-τ药物的包封,其制备简单快速,干扰素-τ包封率很高,并且具有肠溶缓释作用。结论:壳聚糖/海藻酸钠微囊有望用于制备干扰素-τ或其他肽类药物的口服制剂。

植物表达分泌蛋白的运输及定位

分泌途径主要由内膜系统构成,内质网和高尔基体对于分泌蛋白的运输及定位具有重要作用。分泌蛋白的运输包括顺行途径和逆行途径。蛋白质通过质流和受体介导的途径运输到小泡中。在植物中,分泌蛋白的运输主要通过小泡和相连的小管来完成。分子伴侣和质量控制不仅能优化新合成蛋白的折叠和组装,而且去除了有折叠缺陷的蛋白。分泌蛋白的定位需要特定的信号肽,而高尔基体固有蛋白以依赖跨膜长度的方式,沿着分泌途径的细胞器分布。本文对植物表达分泌蛋白的分泌途径及定位、相关的分子伴侣和质量控制进行了综述。

干扰素-τ治疗多发性硬化症的临床应用前景

作为从反刍动物体内发现的一种新型干扰素,干扰素-τ(IFN-τ)具有免疫调节、低细胞毒性等特点。实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化症(MS)的动物模型。IFN-τ能够抑制实验性脑脊髓炎的发生、发展。本文简要综述了IFN-τ的结构、生物活性、低细胞毒性,以及它对EAE的治疗作用和机制。

阿司匹林、舒林酸对3AO细胞环氧合酶-2、血管生长因子、层粘蛋白受体、CD_(44)V_6表达的影响

目的 :研究阿司匹林、舒林酸对 3AO细胞环氧合酶 2 (COX 2 )、血管生长因子 (VEGF)、CD44V6及层粘蛋白受体 (LN R)表达的影响。方法 :采用MTT方法观察阿司匹林、舒林酸在贴壁前后加入培养液中对 3AO细胞生长的影响。采用免疫细胞化学的方法研究两种药物对 3AO细胞COX 2、VEGF、CD44V6、LN R的影响。结果 :MTT实验显示阿司匹林、舒林酸不论在贴壁前还是后加入均可抑制 3AO卵巢癌细胞的生长 ,加药后调节pH可减弱生长抑制作用但仍然可明显抑制肿瘤细胞的生长。阿司匹林和舒林酸对COX 2、VEGF的表达也有抑制作用 ,但对CD44V6及LN R的表达无明显影响。结论 :抑制COX 2的表达可以下调VEGF的表达 ,从而抑制肿瘤的血管生成。阿司匹林和舒林酸可通过抑制COX 2及VEGF的表达而抑制肿瘤的生长。

人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP二级结构及其抗原表位预测

用Garnier-Robson和Chou-Fasman方案预测人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的α-螺旋、β-折叠及转角的二级结构,用Kyte-Doolittle及Hopp-Woods亲水性方案预测其B细胞表位。研究结果表明,pp150/MDBP融合蛋白可能含有较少的α-螺旋,但可能含有较多的β-折叠及转角;B细胞识别的表位可能在7-56氨基酸残基或附近以及137-192残基或附近。