印度尼西亚Padang Cermin热泉古菌多样性分析

通过印度尼西亚苏门答腊岛Padang Cermin热泉环境基因组DNA构建古菌16SrRNA基因文库,并利用PCR-RFLP技术对其古菌多样性和系统发育分析进行了研究。根据限制性内切酶AluⅠ和MspⅠ的特征性酶切图谱,将62个阳性克隆归类为14个分类操作单位(operational taxonomic unit,OTU),文库的覆盖度达90.32%。克隆文库的优势类群为OTU2和OTU1,分别占克隆文库的27.42%和20.96%。从每个OUT中选取一个代表性克隆进行16SrRNA基因的序列测定与系统发育分析,结果表明,测定的Padang Cermin热泉中的古菌均属于泉古菌门,包括热变形菌目(Thermoproteales)、硫还原球菌目(Desulfurococcales)、杂色泉古菌(miscellaneous crenar-chaeotic group,MCG)和未培养泉古菌(uncultured Crenarchaeota,UC),该热泉代表性克隆与GenBank数据库已有16SrRNA序列的相似性为91.9%～97.8%,而且与其相似性最高的序列均来自未培养的古菌克隆,由结果可见,Padang Cermin热泉古菌群落与已报道的其他热泉古菌群落的相似性较低,表明该热泉可能具有某些独特的特征,存在着特殊的古菌生态类群。

印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究

采用MSM寡营养培养基从印度尼西亚Pantai cermin,Kalianda和Banyuwedang三个地区的热泉水样、泥样以及沉积物样品中分离获得细菌菌株,通过检测蛋白酶产生透明圈和福林酚蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出1株产嗜热蛋白酶的菌株PBI,该菌株经初步鉴定为短杆菌属(Brevibacillus),并对其酶学性质进行了研究。结果表明,菌株PBI产蛋白酶的最适酶活温度为60℃,最适pH值为8.0～9.0,具有较好的热稳定性和pH稳定性,60℃时酶的半衰期为30min,70℃条件下20min仍保持46.1%的酶活,该酶在pH值为5.0～9.0范围的缓冲液中酶活相对稳定。其产嗜热蛋白酶的酶活力最高可达到60.53U/mL,在100℃条件下仍能保留26.37%的相对酶活。Fe2+,Fe3+,Cu2+和Zn2+对嗜热蛋白酶活性具有明显的抑制作用。该嗜热蛋白酶对EDTA敏感,苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽(Leupeptin)、苄眯(Benzamidine)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstain A)对该嗜热蛋白酶都有一定的抑制作用,说明其酶活性受到丝氨酸、半胱氨酸残基的影响。结果表明,该菌株是1株具有进一步改造利用价值的产蛋白酶菌株。

印尼3个地区热泉中可培养细菌的分子鉴定与系统发育分析

采用MSM寡营养培养基从印度尼西亚Pantai cermin,Kalianda和Banyu wedang地区的热泉水样、泥样以及沉积物中根据菌落的形态学特征共分离获得69株细菌,通过菌株的16S rDNA的限制性片段长度多态性(PCRRFLP)分析、序列比对和生理生化分析,对其进行鉴定并构建系统发育树。结果表明,分离获得的69株细菌菌株分别属于8种基因型(Ⅰ～Ⅷ),其中1类(基因型I)属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus),约占20.28%;1类(基因型Ⅷ)属于地芽孢杆菌属(Geobacillus),约占14.49%;其余6类(基因型Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ)均属于芽孢杆菌属(Bacillus),约占总菌株数量的65.22%,为优势菌群。分离获得的8类细菌均为革兰氏阳性兼性好氧菌,接触酶、氧化酶反应均呈阳性,吲哚反应都呈阴性。产酶实验表明,分离到的菌株在中性pH值,37～70℃范围内能够分泌多种耐热的水解酶类,4种基因型(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)的菌株分泌蛋白酶,5种基因型(Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ)的菌株分泌水解脂肪酶,1种基因型(Ⅳ)的菌株分泌淀粉酶,并且发现其中1种基因型(Ⅳ)的芽孢杆菌可同时产生3种水解酶类。利用限制性内切酶AluI对16S rDNA进行的RFLP技术分析结果表明,利用该技术能够对嗜热细菌的16SrDNA多样性进行有效的分析,经凝胶电泳图谱将菌种鉴定到属的水平,揭示了印尼热泉生态系统中蕴藏着丰富的嗜热菌菌种资源。