高校ABSL-2实验室流程管理的实践探讨:以厦门大学为例

建立标准化、科学化、规范化的动物生物安全二级(animal biosafety level-2,ABSL-2)实验室是支持高校涉及病原微生物教学和科研工作顺利开展的重要保证。本文以厦门大学实验动物中心ABSL-2实验室为例,分别从资质备案,生物安全管理体系文件,日常工作管理,压力梯度控制,人员、动物及物品的管理,生物安全监督检查,以及废弃物处理等方面,详细阐述了ABSL-2实验室的运行及管理模式,并针对管理过程中遇到的问题提出应对措施。

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法本研究针对鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecf X基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。

早期糖尿病视网膜病变中eEF2K活性变化的实验观察

目的观察早期糖尿病大鼠视网膜中真核生物延伸因子2激酶(e EF2K)的变化,探讨e EF2K活性变化在早期糖尿病视网膜病变(DR)中的意义。方法建立SD大鼠链脲佐菌素(STZ)糖尿病高血糖模型,造模成功后,设立糖尿病大鼠(DM)组和正常对照(NC)组。qRT-PCR检测DM组和NC组4周和8周时大鼠神经视网膜中e EF2K的表达情况。免疫荧光法观察定位神经视网膜中e EF2K激活标志物-磷酸化真核生物延伸因子2(p-eEF2)和Müller细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况。结果 4周和8周时DM组大鼠神经视网膜中e EF2K的表达水平与NC组相比无明显变化。8周时DM组大鼠神经视网膜各层均出现e EF2K激活表现,即p-eEF2表达增强。神经节细胞层出现细胞凋亡样改变,凋亡样神经节细胞中e EF2的磷酸化水平增强最为明显。神经视网膜中Müller细胞活化,GFAP蛋白表达增强。结论 STZ诱导糖尿病大鼠早期视网膜病变中神经视网膜内e EF2K激活,在凋亡样神经节细胞中e EF2K活性上升最为显著。

氯喹抗冠状病毒的作用及其安全性研究进展

冠状病毒作为一种人畜共患病毒,可引起肺部感染,严重的会引起死亡甚至肆虐传播。2019年12月底陆续出现了新型冠状病毒——严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者。针对冠状病毒,目前并无特效药。氯喹作为一种经典抗疟药,可通过改变内吞体pH值、自噬反应以及改变病毒包膜的糖基化模式等途径发挥抗病毒效应。在细胞水平上,氯喹对SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和SARS-CoV-2均有抑制作用。近期临床研究初步表明,氯喹可以提高COVID-19患者成功救治率,改善预后。由于氯喹副作用较多,近些年已经较少用于临床,氯喹用于治疗COVID-19的安全性需要深入评估。本文结合氯喹的药理学特点,针对氯喹抗冠状病毒感染的作用及其安全性作一概述,以期为其临床合理应用提供参考。

利用CRISPR/Cas9技术制备Mindin基因敲除小鼠

针对Mindin基因编码序列设计3条单链向导RNA(sgRNA),制备相应质粒,将表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒共同电转入小鼠成纤维细胞L929中,通过药物筛选获得细胞库.经单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,选择效率最佳的sgRNA.体外转录获取sgRNA和Cas9mRNA,进行小鼠受精卵的显微注射后提取小鼠基因组DNA测序鉴定.产生的40只小鼠中17只发生不同程度的碱基插入或缺失,其中23号小鼠缺失10个碱基造成移码突变,Mindin基因表达被破坏,成功构建出Mindin基因敲除小鼠,为深入研究Mindin基因的生物学功能奠定了基础.

四氧嘧啶诱导大鼠糖尿病模型的建立

目的研究四氧嘧啶造大鼠糖尿病模型的最适给药方案。方法分别给大鼠不同的造模给药方案,在30 d内测定空腹血糖值,并统计实验期间动物的体重及存活率。第1组给药方案:腹腔注射四氧嘧啶(160 mg/kg BW);第2组给药方案:腹腔注射四氧嘧啶(120 mg/kg BW),24 h后第2次给药,腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg BW);第3组给药方案:腹腔注射四氧嘧啶(120 mg/kg BW),24 h后第2次给药,腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg BW)。第1次腹腔注射四氧嘧啶后,将饮水更换为20%葡萄糖溶液。并维持高糖饮水1周。对照组给予同等体积生理盐水。结果第1组的大鼠存活率为60%,模型成功率为20%;第2组的大鼠存活率为65%,模型称功率为55%;第3组的大鼠存活率为100%,模型成功率为85%。结论采用2次小剂量注射四氧嘧啶,并在给药后高糖饮水可以大大提高糖尿病大鼠造模的存活率及模型成功率。

基于真实世界数据挖掘在冠心病临床诊断中的应用研究

目的基于真实世界数据探讨数据挖掘技术在冠心病临床诊断中的应用.方法收集2019年5月至2020年5月福建省某三甲医院老年人电子病例数据,从中随机选取87例老年冠心病患者作为研究组,并选取同时期就诊的86例老年人为对照组.采用各种数据挖掘方法分析两组病例与冠心病可能有关的临床指标,建立冠心病诊断模型.结果数据挖掘分析预测冠心病的准确率与冠状动脉造影确诊冠心病结果的一致性较高.结论基于真实世界数据应用数据挖掘技术建立冠心病诊断预测模型具有较高的诊断精度,为临床的早期诊断和治疗提供参考意见,确诊仍需冠状动脉造影检查.

PCR技术在SPF级实验动物鼠检测中的应用

PCR作为一项新兴技术,越来越受到人们的重视。近几年来,PCR技术不断发展,它以准确、快速、便捷等优点广泛应用在科学研究的各个领域。PCR技术应用在实验动物领域中,可提高实验动物临床检测和监测水平。笔者主要介绍PCR技术在SPF级实验动物鼠病原微生物检测中的应用。

人红细胞凝集型单抗的制备与鉴定

目的制备人红细胞凝集型单克隆抗体并进行鉴定。方法以3种方式处理人血红细胞,获得红细胞免疫原,分别免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以凝集实验筛选分泌凝集型抗体的杂交瘤细胞,继而用有限稀释法克隆3次,并对杂交瘤细胞的稳定性进行测定。通过腹水法制备抗体,亲和层析法纯化抗体,对抗体的特性进行研究。结果 3种方式获得的免疫原均能建立有效的免疫反应,低渗加超声破碎法所获得的小鼠血清抗体效价最高。通过融合获得8株可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,其中,4A1分泌的抗体凝集效价最高。抗体可使4种人血型的红细胞凝集,无种属交叉凝集反应。结论有效制备了针对人红细胞的凝集性单抗,为其之后的应用研究奠定了基础。

葡萄糖依诺沙星注射液的异常毒性检查与体外溶血反应研究

目的:对葡萄糖依诺沙星注射液进行异常毒性检查和体外溶血反应研究,为其安全用药提供参考。方法:根据2015年版《中国药典》(二部)附录中"异常毒性检查法",使用小鼠进行葡萄糖依诺沙星注射液半数致死量(LD_(50))的测定和异常毒性限值的设定。根据2015年版《中国药典》(二部)附录中"溶血与凝聚检查法",使用兔血进行体外溶血和凝聚反应的研究。结果:测得葡萄糖依诺沙星注射液对小鼠的LD_(50)为248.9 mg/kg,其异常毒性检查项设定的限值为28.4 mg/kg,按此限值检查结果均符合相关规定。以临床最大剂量(0.2 g/100 mL)进行溶血与凝聚反应的检查结果均符合规定。结论:为减少临床不良反应和确保质量标准的可行性,葡萄糖依诺沙星注射液的异常毒性检查限值应设定为28.4 mg/kg。

华南三省(自治区)部分西番莲种植区花叶病病原检测及EAPV多聚蛋白基因序列分析

西番莲(Passiflora edulis Sims.)是热带亚热带地区重要经济作物,我国福建、广东、广西、海南等地广泛种植[1]。调查发现,我国南方多地西番莲花叶病为害严重,症状表现为叶片花叶、黄化、斑驳、畸形,甚至整株褪绿,严重影响西番莲的产量和品质。

黄连素对多囊卵巢综合征大鼠高雄激素状态及StAR蛋白表达的影响

目的:研究黄连素对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠治疗作用及机制。方法:将48只6周龄SPF级雌性SD大鼠随机分为空白对照组和造模组,造模组采用来曲唑(1mg·kg-1·d-1)灌胃诱导PCOS模型。造模结束后,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、二甲双胍组、黄连素组,每组11只。治疗期间空白对照组、模型对照组均用1%羧甲基纤维素灌胃,二甲双胍组用1%羧甲基纤维素+二甲双胍(135mg·kg-1·d-1)灌胃,黄连素组用1%羧甲基纤维素+黄连素(81mg·kg-1·d-1)灌胃。测定大鼠血清睾酮、空腹胰岛素,光镜下观察大鼠卵巢HE染色病理片和St AR免疫组化病理片。结果:本实验模型大鼠出现典型的PCOS表现:卵巢呈多囊样改变;血清睾酮升高(P<0.05);空腹胰岛素升高(P<0.01),提示存在胰岛素抵抗。二甲双胍和黄连素均能改善模型大鼠的胰岛素抵抗,但黄连素降低睾酮的能力优于二甲双胍(P<0.05)。卵泡膜细胞的细胞膜上St AR密度随睾酮值升高而升高。结论:黄连素有治疗PCOS的作用,它不仅能改善胰岛素抵抗,还能通过降低卵泡膜细胞的细胞膜上St AR密度降低血清睾酮值,治疗高雄激素血症。

一种快速准确的微藻生物量估算法

随着微藻在水产养殖业、生物能源、保健品制造等领域的广泛应用,对人工培养的微藻进行实时生物量测定的需求不断增长。由于在微藻的完整生长周期中色素成分在不断变化,传统的分光光度法这一无损监测手段会产生较大误差。本研究从微藻光谱组成进行分析,指出单波段模型其局限性产生的机制,并采用以分光光度法为基础的导数模型对叶绿素a进行估算。该模型不受样品所处生长周期的影响,只需一个样品就能获得模型参数。利用该模型对叉鞭金藻(Dicrateria sp.)、等鞭金藻(Isochrysis sp.)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)全生长周期的叶绿素a含量进行测定,拟合度(R2)分别达到0.984、0.992、0.966。该算法简单快速,精确度高,非常适用于微藻培养进入平台期或衰退期的评估和判断,可为在线监测的仪器设备的研制提供新思路。

新型可控性栓塞剂MNPs-tTF的构建

目的:构建新型的具有可控性且能诱发动物血栓的栓塞剂——磁靶向凝血蛋白,从而为动物血栓模型的建立提供新工具。方法:使用化学共沉淀法合成磁流体(magnetic nanoparticles,MNPs),通过透析对其纯化后用超导量子干涉磁强针(SQUID)测定其磁性能;利用基因工程方法表达截短组织因子(truncated tissue factor,tTF)(又称为凝血蛋白)并纯化与鉴定;采用戊二醛交联法构建磁靶向凝血蛋白(MNPs-tTF),体外分析其磁控靶向性及凝血效力。结果:成功构建了磁靶向凝血蛋白MNPs-tTF,体外实验证实其保留有磁流体MNPs的磁控靶向性,以及凝血蛋白tTF的凝血效力。结论:成功构建了磁靶向凝血蛋白MNPs-tTF,为血栓模型动物的建立提供一种新工具。

神仙鱼

纳米药物进入小鼠来源神经瘤母细胞溶酶体的共定位现象,图片由高灵敏度激光共聚焦显微镜Zeiss LSM 880600×拍摄。图中红色荧光为纳米药物,绿色荧光为溶酶体探针,药物在溶酶体内较低pH值条件下释放,发挥药效。镜头下伸展开的细胞像一尾正在遨游的七彩神仙鱼。

SPF级小鼠肺支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立及应用SPF级小鼠肺支原体实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GenBank中肺支原体16S rRNA基因序列的高度保守区域设计引物,建立了可快速、准确检测肺支原体的实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性以及疑似支原体感染样本检测,并评论其可行性。结果表明：所建立的qPCR方法具有良好的线性关系,标准曲线的相关系数R^2=0.999;5种相关的细菌检测结果均为阴性,特异性好;其检测灵敏度为10 copies/μL;组间样本的变异系数均小于3%,重复性好;对60份疑似支原体感染的小鼠咽拭子样本检测结果比采用ELISA方法以及常规PCR更灵敏。说明SPF级小鼠肺支原体的qPCR方法较之于ELISA方法及常规PCR具有快速、灵敏性高、特异性强、稳定性好等特点,能更好地进行小鼠肺支原体的快速检测和诊断。