杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。

Tat修饰Au-Au2S纳米颗粒的合成及其穿膜机制

为了实现对肿瘤的靶向性药物/基因治疗,通过化学还原法制备了细胞穿膜肽Tat修饰的Au-Au2S纳米药物载体。采用透射电镜、表面增强拉曼光谱仪、紫外分光光度计对Tat/Au-Au2S纳米粒子进行表征,采用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜研究Tat/Au-Au2S纳米粒子的穿细胞膜机制。理化分析结果表明,Tat可通过Au—S键接枝于Au-Au2S纳米粒子表面,直径约50 nm的Tat/Au-Au2S纳米粒子具有近红外敏感性。细胞内化途径示踪物共定位分析和抑制剂阻断实验表明,Tat/Au-Au2S纳米粒子以脂筏介导的巨胞饮途径进入Hela细胞,而以受体和脂筏共介导的巨胞饮途径进入骨髓间充质干细胞(BMSCs)。