应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

摘要：目的研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒（探针熔解分析）的临床应用价值。方法用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性，用菌株H37Rv考察其检测限，并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变，检测结果经测序验证。结果37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰，检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌。

实时聚合酶链反应熔解曲线法快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的应用实时PCR熔解曲线法快速检测MTB对利福平和异烟肼的耐药性，并与比例法检测结果进行比较。方法收集深圳市2007--2009年耐药监测项目、全国耐药基线调查项目和深圳市慢性病防治中心门诊患者临床分离株311株，采用实时PCR熔解曲线法检On,0rpoB基因耐药突变热点区、ahpC启动子区（硝～30及-15～-3位点）、inhA启动子区（-7～-8位点）、inhA94和katG315位耐药突变，并与耐药基因测序及表型药敏试验结果进行比较。以比例法药敏试验结果作为MTB药敏试验的金标准，评价实时PCR熔解曲线法的敏感度、特异度与金标准的符合率。结果实时PCR熔解曲线法2～3h即可完成检测，扩增和结果判定在1个反应管内完成。检测利福平耐药的敏感度为97．8％，特异度为97．1％，准确性为97．4％；检测异烟肼耐药的敏感度为86．6％，特异度为98．7％，准确性为92．6％。对耐多药MTB的检测敏感度为88．6％，特异度为100．O％，重复性为100．0％。结论实时PCR熔解曲线法检测MTB对利福平和异烟肼耐药性，与比例法检测结果比较具有很好的一致性，且具有快速、准确的优点，有较好的临床应用价值。

探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区（- 17～-8位点）、ahpC启动子区（-44～-30以及-15 ～3位点）及inhA94位密码子的熔解温度（Tm值）差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％（ 162/833）,在所检出的14种INH耐药突变katGS315T（ AGC →ACC）、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N （AGC→AAC）这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％（135/162）.结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.

PCR-探针熔解分析法检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药基因突变的临床应用评价

目的评价PCR-探针熔解分析法(PMAA)检测结核分枝杆菌(MTB)氟喹诺酮(FQ)药物耐药性的临床应用价值。方法采用常规比例法和PCR-PMAA对509株MTB临床分离株进行FQ药物敏感性试验。对69株比例法和(或)PCR-PMAA法检测耐药以及440株两法检测均敏感的MTB菌株中抽取的55株菌株,进行FQ药物耐药相关基因gyrA和gyrBPCR-DNA测序。结果以常规比例法为标准,PCR-PMAA检测FQ药物耐药性的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值、符合率及约登指数分别为97.01%、99.55%、97.01%、99.55%、99.21%及0.97。比例法和(或)PCR-PMAA检测耐药的69株中,经DNA测序证实44株gyrA94位密码子GAC→AAC(D→N)或CAC(H)或GGC(G)或GCC(A)突变;4株gyrA91位密码子TCG→CCG(S→P)突变;19株gyrA90位密码子GCG→GTG(A→V)或AAG(K)突变;1株gyrB500位GAC→AAC(D→N)突变;1株在测序范围未见突变。55株两法检测均敏感样品DNA测序结果证实,gyrA和gyrB基因均未见耐药相关的基因位点突变。结论 PCR-PMAA法能高效检出MTBFQ药物耐药相关基因突变,用于检测MTBFQ药物耐药性敏感性高,特异性强,方法简便、快速、价廉,具有良好的临床应用前景。

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒（探针熔解分析）的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.