强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

群体感应在发酵食品中的研究进展

微生物在发酵食品中起着重要作用,群体感应作为微生物依赖于细胞密度而调控其生理行为的一种机制,在发酵食品中也应受到关注。近年来有研究表明发酵食品中群体感应的调控与食品品质及风味有着密切的联系。因此,该文综述了群体感应信号分子的定义及分类、群体感应对发酵体系中微生物和各种发酵食品的调控作用,最后对群体感应在发酵食品行业中的研究及应用前景进行了总结与展望,以期为发酵食品产业提供新的见解。

构建大肠杆菌合成生物群落利用混合糖同步发酵生产L-乳酸

目的:实现大肠杆菌混合糖发酵产L-乳酸过程中对葡萄糖-木糖的同步利用。方法:以L-乳酸工程菌大肠杆菌JH16(E.coli B,△frdBC△pflB△ackA△adhE,ldhA::ldhL)为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除木糖转运及代谢基因xylFGH、xylE和xylA,获得不能利用木糖的菌株大肠杆菌JH16031。以大肠杆菌JH2705(E.coli JH16,△ptsG△mglB)为出发菌株,敲除葡萄糖转运及代谢基因crr、malX和galP,获得不能利用葡萄糖的菌株大肠杆菌JH27071,以构建大肠杆菌合成生物群落。通过摇瓶和5 L发酵罐试验确定该合成生物群落在混合糖发酵时较优的混合接种比例。结果:以60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源进行发酵,当JH16031与JH27071初始接种比为1∶50,初始OD_(600nm)=0.5,混合糖的利用率最高,在84 h内消耗97%的糖,并在96 h内结束发酵。葡萄糖消耗速率为705 mg/(L·h),木糖消耗速率为435 mg/(L·h),L-乳酸产率为951 mg/(L·h),L-乳酸产量达到92 g/L,糖酸转化率为91%。结论:构建大肠杆菌合成生物群落可实现利用混合糖发酵产L-乳酸过程中葡萄糖和木糖的同步利用。研究结果为工业发酵生产中,使用低成本的木质纤维素为原料,降低发酵成本,提高混合糖利用率提供技术支持。

球孢白僵菌利用D-PPA合成D-HPPA的发酵条件优化

为了提高球孢白僵菌(Beauveria bassiana)利用R-(+)-2-苯氧基丙酸(D-PPA)合成R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)的能力,在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman设计和Box-Behnken中心组合设计优化球孢白僵菌生物合成D-HPPA的液态发酵条件。结果表明,当D-PPA初始添加浓度为40 g/L时,液态发酵最优条件为葡萄糖38.70 g/L、蚕蛹粉15 g/L、FeCl_(2)1.0 g/L、接种量15%(V/V)、pH 6.6及发酵温度28℃时,D-HPPA的产量为(25.10±0.43)g/L,D-HPPA的产率为57.24%±0.97%,比优化前提高了159%。

基于氢氧化钙为中和剂的大肠杆菌丁二酸发酵

氢氧化钙因其价格相对低廉且与其配套的有机酸分离纯化工艺成熟,常作为中和剂应用于有机酸发酵中。但在丁二酸发酵中,因其不能提供丁二酸合成所必需的二氧化碳,存在发酵产量低的问题。文章建立并优化了以氢氧化钙为中和剂结合二氧化碳脉冲补料发酵生产丁二酸的方法。发酵初期不添加中和剂,pH值自然下降至5.7时,立即流加23%氢氧化钙溶液使pH值升至7.5,然后停止添加中和剂,通入0.2 m^(3)/(m^(3)·min)二氧化碳气体至pH值降至6.5时停止通气使发酵液自然发酵,当pH值下降至5.7时,再循环上述操作。使用该方法时,发酵产量为88.47 g/L,糖酸转化率为96.03%,平均生产强度为2.21 g/(L·h),相较于以氢氧化钙为中和剂不补入或者连续通入二氧化碳的方式,糖酸转化率分别提高了298%和95%。该方法为解决使用氢氧化钙作中和剂发酵丁二酸产量低的问题提供了新思路,也为利用现有有机酸分离设备大规模生产丁二酸打下了良好基础。

燕麦米酒发酵工艺优化及其抗氧化活性研究

采用燕麦(Avena sativa L.)和糯米(Oryza sativa)为主要原料发酵制备燕麦米酒。为优化燕麦米酒发酵工艺,将燕麦粉液化后加入米酒发酵,同时以感官评分和酒精度为评价指标,通过单因素试验及响应面法优化燕麦米酒发酵条件,并对其品质指标及抗氧化活性进行分析。结果表明,与添加燕麦仁半固态发酵制备的米酒相比,燕麦粉液化后发酵制备的米酒出酒率提高40.6%。燕麦米酒最佳发酵条件为燕麦汁添加量21%,发酵时间4.5 d,酵母菌接种量0.15%,发酵温度31℃。在此优化条件下,燕麦米酒风味口感俱佳,具有独特的燕麦香味,感官评分为89分,酒精度为8.00%vol,总多酚含量为0.69 g/L,还原糖含量为37.40 g/L,总酸含量为5.92 g/L,非糖固形物含量为13.70 g/L,其各项理化指标均符合相关标准要求。抗氧化研究结果表明,燕麦米酒的1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除率,铁离子还原能力(FRAP)分别为纯糯米酒的1.08倍、1.31倍、1.69倍,其抗氧化能力优于纯糯米酒。

不同香型大曲微生态结构及其发酵特性相关性分析

以清香型、浓香型和酱香型白酒大曲为研究对象,采用理化分析、顶空固相微萃取气相色谱-质谱检测和高通量测序技术,探究不同香型大曲微生态与理化指标和酒质特征风味化合物的潜在关系。结果表明,清香大曲的糖化力和发酵力最高,浓香型大曲的酯化力和淀粉含量最高,酱香型大曲的酸度最高。3种香型大曲优势细菌属包括乳酸杆菌属(Saccharopolyspora)、魏斯氏菌属(Weissella)、芽孢杆菌属(Bacillus);优势真菌属包括复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热霉菌属(Thermomyces)。相关性分析表明,芽孢杆菌属与糖化力、液化力、发酵力、癸酸乙酯、苯乙醇呈正相关;嗜热霉菌属与己酸乙酯、异戊醇、乳酸乙酯、乙酸、川芎嗪呈正相关。

板枣发酵酒的生产工艺优化及体外消化

为改善枣酒的品质,丰富枣酒香气,生产出酒体绵软适口,醇厚香浓的板枣果酒。本文采用单因素实验、神经网络和遗传算法优化发酵工艺,并通过体外消化实验对其发酵前后在胃肠道中的消化特性和抗氧化活性进行研究。结果表明,板枣酒的最佳辅料为山楂,最优发酵条件为:山楂与板枣的比例为1:2.96(w/w),发酵温度29℃,浸提温度45℃,感官评分为81.66分。体外消化结果表明:板枣发酵酒总酚含量、DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率在胃消化结束后分别提升了16.19%、22.15%和13.09%,在肠消化结束后提升了42.06%、22.31%和85.80%。本研究为板枣发酵酒产品的开发和工业化生产提供了参考。

HIP1过表达对酿酒酵母工程菌麦角硫因产量的影响

麦角硫因是一种普遍存在于高等动植物体内的天然抗氧化剂,具有减少细胞氧化损伤、抗炎和治疗相关疾病的能力,被广泛应用于食品、化妆品和医药行业。与传统的植物提取法及化学合成法相比,通过微生物合成法制备麦角硫因具有周期短、成本低和产量高等优势。该研究以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D为出发菌株,利用CRISPR/Cas9系统向其基因组中引入异源酶基因,构建具有完整麦角硫因生物合成途径的酿酒酵母工程菌。为进一步提高其产量,过表达组氨酸特异性转运蛋白Hip1p后,在仅有0.5 mmol/L组氨酸供给条件下,菌株胞内游离组氨酸水平显著提高,且麦角硫因产量提高10%。最终经摇瓶发酵72 h产量达(6.88±0.11)mg/L,而在5 L罐补料分批发酵策略下,培养72 h后麦角硫因产量达237.34 mg/L。该研究为后续代谢工程改造产麦角硫因酿酒酵母工程菌株提供靶基因参考。

结构脂质的酶法合成及应用酶工程提高其合成效果的研究进展

基于利用脂肪酶对天然油脂进行改性生成结构脂质(Structured Lipids,SLs)可赋予油脂额外的健康属性,有效提高产品附加值,对近期报道的各类SLs酶法合成及通过酶工程技术(结构设计和固定化)提升合成效果的研究进行综述,认为,使用sn-1,3位置专一性脂肪酶可精准合成SLs,利用分段变温反应、超临界流体反应、真空反应、超声波辅助等途径可有效抑制酰基转移,从而提高产物得率;脂肪酶的结构设计可提高其催化效率、稳定性和底物专一性,使SLs的合成效率和得率有所提升;固定化脂肪酶技术也能提高脂肪酶的反应活性和稳定性,增强其重复利用性,降低SLs酶法合成的成本。未来应针对不同SLs的结构特点,通过结构设计获得高活性、高稳定性和专一性的酶分子,结合新型固定化技术创制高性能酶制剂,以期为高效、精准的SLs酶法合成工艺的创新发展提供参考。

高产乙酸乙酯酵母菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

该研究以产酯酵母为研究对象,通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术测定菌株的乙酸乙酯产量并筛选高产乙酸乙酯的酵母菌株,通过形态学观察和分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并以乙酸乙酯产量为响应值,通过单因素及响应面试验对其发酵条件进行优化。结果表明,筛选得到一株高产乙酸乙酯的酵母菌株P-3,乙酸乙酯产量为134.32 mg/L。菌株P-3被鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),其产乙酸乙酯的最佳发酵条件为:发酵温度30℃,乙醇体积分数18%,发酵时间4 d,在此条件下,乙酸乙酯产量达到281.47 mg/L,比优化前提高109.55%。

板枣酒发酵过程中的香气变化规律及特征香气分析

目的探究板枣酒发酵过程中的香气变化规律以及特征香气。方法采用顶空固相微萃取将DVB/CAR/PDMS提取纤维置于顶空部分,从而吸附样品中的挥发性有机化合物。再利用气相色谱-质谱法对挥发性物质进行测定,结合香气活性值与感官评价标准等对其进行分析评价。结果发酵过程中共出现了57种挥发性物质,醇类14种,酯类19种,酸类8种,醛酮类8种,芳香烃类8种。己酸乙酯,辛酸乙酯,苯乙酸乙酯,月桂酸乙酯,3-苯丙酸乙酯,正辛醛,苯乙醛,大马士酮和丁香酚为板枣发酵酒中的主要香气成分。通过主成分分析可将发酵过程分为3个阶段,并分析不同阶段的发酵过程得到香气变化规律,结合偏最小二乘分析(partial least squares,PLS)确定发酵过程中对感官评分影响最大的萘、苯乙醛、葵酸乙酯、苯甲酸乙酯、异戊醇5种香气成分。结论部分香气成分的含量在发酵过程中逐渐消失,同时也产生新香气成分。苯乙醛、葵酸乙酯、苯甲酸乙酯、异戊醇这4种特征香气成分的含量与感官评分呈正相关,因此可以调控发酵过程,更多生成这些香气成分,使酒体的香气更丰富,酒体更醇厚。

白酒糟水解液中丁醇发酵抑制物的筛选及其对丁醇发酵的影响

白酒糟经酶解后可作为丁醇发酵的优良原料,但其水解液中含有的抑制物质会对丁醇发酵造成影响。该研究利用Ca(OH)2对酒糟水解液进行脱毒处理。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对酒糟水解液中的主要成分进行分析,并应用多元统计分析方法确定主要的抑制物质种类。结果表明,酒糟水解液中共检测出18种化合物,其中酸类和酯类含量最高,分别为232.81 mg/L和126.69 mg/L。用Ca(OH)2脱毒处理表明对酸类和酯类物质的去除率最高,分别达到38.2%~78.9%和83.1%~93.3%,最佳脱毒条件为pH 10,25℃处理1 h。结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘分析(PLS)结果,油酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸、己酸是丁醇发酵的显著负相关因子。潜在抑制物单因素试验结果表明,己酸添加量达800 mg/L时,对丁醇发酵有显著抑制作用(P<0.05),其他四种物质对其没有显著影响(P>0.05)。五类物质(等量混合)添加量达400 mg/L时,其对丁醇发酵具有协同抑制作用(P<0.05),丁醇含量相比于对照组减少了29.1%。综上,两种酸类和三种酯类物质是酒糟水解液中的潜在抑制物,其协同作用抑制了丁醇发酵。

凝结芽胞杆菌发酵优化工艺

为提高凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)的生长效率,在摇瓶、发酵罐水平考察了最适的碳源、温度、维生素添加量、pH以及发酵过程存在的氧化胁迫对凝结芽胞杆菌生长代谢的影响,获得了发酵培养基配方,并确定了30 L发酵罐最适培养条件:培养温度为40℃,初始pH为6.2~6.5,培养过程中9~14 h用氨水溶液控pH=5.5,pH大于5.5后停止控制,全程以4.1 mg/(L·h)速率流加半胱氨酸。优化条件下,发酵13 h细胞生物量达1.9×10^(10)CFU/mL,较对照提高363.4%,细胞生长效率为1.5×10^(9) CFU/(mL·h),较对照提高305.4%。显著提高了生物量、缩短了发酵周期,为凝结芽胞杆菌工业化生产提供了重要参考。

高光学纯度L-乳酸工程菌的构建及其蔗糖发酵

本研究以可利用蔗糖发酵产D-乳酸的工程菌WD 206为出发菌株(ΔcscR,ΔadhE,ΔfrdBC,Δpta,ΔpflB,Δal-dA),敲除D-乳酸脱氢酶基因(ldhA),并插入乳酸片球菌pediococcus.acidilactici的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL),以构建L-乳酸工程菌WL306。该菌在60h的发酵过程中,可将100g/L的蔗糖转化生成81.92g/L的乳酸,产率为82%,在发酵产物中占99.5%;L-乳酸的光学纯度高达99.9%。该结果说明此工程菌具有生产高纯度L-乳酸的工业开发潜力,为采用廉价碳源材料(甘蔗渣,糖蜜)生产打下良好基础。

大肠杆菌工程菌利用玉米浆发酵产L-乳酸的研究

在以玉米浆为有机氮源,葡萄糖结晶废糖液为碳源的发酵培养基上对大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了4L发酵产L-乳酸研究,确定了HBUT-L在玉米浆发酵培养基中能生长,并且可高效快速地将葡萄糖发酵转化成L-乳酸。乳酸产量达到108.3g/L,50h内发酵结束,L-乳酸光学纯度在99%以上,糖酸转化率在97%以上,产率为2.16g(/L.h),是无机盐发酵培养基产率的79.7%。为HBUT-L利用玉米浆发酵产L-乳酸,降低生产成本及其工业化提供参考。

大肠杆菌工程菌利用甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸研究

大肠杆菌HBUT-L来源于HBUT-D,因此具有快速利用蔗糖的特性。对HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜发酵产L-乳酸的特性进行了研究。结果表明,该菌株在96 h的发酵过程中,可将100 g/L的蔗糖转化生成60.0 g/L乳酸,转化率达到74.0%,杂酸产量少,具有工业化开发潜力。在玉米浆培养基中可以直接添加未经处理的甘蔗糖蜜,发酵周期持续224 h,发酵液所得乳酸产量为87.0 g/L,发酵液残糖为28.6 g/L,但乳酸产率极低,仅为0.389 g/(L·h),后续将对甘蔗糖蜜预处理工艺进行研究,进一步提高乳酸发酵速度和产量。

D-乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究

以前期构建的D-乳酸大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌LHY02为出发菌株,通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用;采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应,拟进一步提高大肠杆菌发酵产D-乳酸的产量、生产强度和糖酸转化率。结果表明,驯化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖发酵中D-乳酸产量比驯化前提高了36.7%。LHY201结合葡萄糖进行补料发酵(补料方式为8%+8%+4%),乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h,D-乳酸光学纯度达到99.6%,相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵,乳酸产量和糖酸转化率分别提高了21.1%和21.2%,发酵周期缩短了一半。

产胞外谷胱甘肽酿酒酵母的诱变选育及发酵优化

为获得一株能产胞外谷胱甘肽(glutathione,GSH)的突变株,对酿酒酵母GAQ4进行紫外迭代诱变处理,最终筛选得到突变菌株UV3-10,其胞外谷胱甘肽含量为18.56 mg/L,是出发菌株GAQ4胞外谷胱甘肽含量的2.52倍。为进一步提高胞外谷胱甘肽含量,通过单因素试验优化突变株UV3-10发酵条件,得到其最优摇瓶发酵条件为发酵周期48 h、发酵温度34℃、摇瓶转速140 r/min、摇瓶装液量75 mL/300 m L、初始pH值为6.5;优化后其胞外GSH含量达到52.05 mg/L,是发酵条件优化前胞外GSH含量的2.80倍。

中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响

该文对前期构建的产高光学纯度L-乳酸的大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了耐乳酸钠的驯化,并对驯化前后菌株发酵产L-乳酸的中和剂进行了选择和对比。结果表明,经过28代驯化后的菌株HBUT-L16以Ca(OH)_2 作中和剂时发酵效果较Na OH为中和剂时效果好,L-乳酸产量、糖酸转化率及生产强度分别提高了6.6%、5.6%、44.4%。与驯化前菌株HBUT-L的发酵结果相比,HBUT-L16以Ca(OH)_2 为中和剂进行发酵时,乳酸产量提高了4.4%,糖酸转化率提高了2.8%,生产强度增加了26.71%;而以Na OH为中和剂时,对驯化前后菌株的发酵效果影响不大,由此推测耐乳酸钠的驯化主要通过提高工程菌对乳酸根的耐受性而非钠离子的耐受性,来提高L-乳酸的产量。