Sonic hedgehog信号对口腔鳞癌中组蛋白甲基化转移酶的研究

目的检测Sonic hedgehog信号在口腔鳞癌致病过程中是否具有调节组蛋白甲基化转移酶表达的功能。方法利用人重组SHH-N蛋白及过表达M2-SMO在舌鳞状细胞癌细胞系SCC6激活Shh信号,利用Cyclopamine阻断Shh信号,采用Real-time PCR在mRNA水平检测组蛋白甲基化转移酶相关基因的表达。结果发现激活Shh信号通路,组蛋白甲基化转移酶DOT1、MLL2和MLL4在mRNA水平表达明显升高。抑制Shh信号通路,DOT1、MLL2和MLL4表达明显降低。结论在口腔鳞癌中组蛋白甲基化转移酶DOT1、MLL2和MLL4是Shh信号通路的下游基因,其表达受Shh信号分子的正向调控。

脂多糖促进牙周膜间充质干细胞组蛋白去甲基化酶HR表达的研究

目的:脂多糖是否对牙周膜间充质干细胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs)中组蛋白去甲基化酶相关基因表达存在调控功能。方法:利用不同剂量的脂多糖对牙周膜干细胞进行刺激处理;在mRNA水平利用实时定量RT-PCR(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测组蛋白去甲基化酶相关基因的表达。qRT-PCR结果显示HR(hairless homolog)基因在脂多糖刺激后24h和48h结果显示,能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激时间有相关性。1、5和10mg/L脂多糖在作用48h后都能促进HR的表达,其表达升高的水平与脂多糖刺激剂量有相关性。10μg/mL脂多糖抑制牙周膜干细胞体外矿化能力。结论:在牙周膜干细胞中脂多糖对牙周膜干细胞组蛋白去甲基化酶HR的表达有促进作用。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖促进人牙周膜干细胞组蛋白甲基化转移酶PRDM9的表达研究

目的研究牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)对牙周膜间充质干细胞(PDLSCs)组蛋白甲基化转移酶PRDM9的作用及调控机制。方法选择不同浓度的Pg. LPS处理PDLSCs;利用实时定量RT-PCR的方法检测多种组蛋白甲基化转移酶在mRNA水平的表达变化;此外在Pg. LPS处理细胞的同时加入0.5μg/ml TLR4中和抗体,比较阻断及未阻断情况下筛选出的差异基因在mRNA水平的表达变化。结果实时定量RT-PCR结果显示PDLSCs在10μg/ml Pg. LPS刺激24 h和48 h后,组蛋白甲基化转移酶PRDM9基因表达量显著升高,具有时间相关性。选用1、5和10μg/ml的Pg. LPS处理PDLSCs,48h后检测到PRDM9表达量升高与Pg. LPS呈剂量相关性;与对照组相比阻断TLR4信号通路使得PRDM9的表达量明显下调。结论 Pg. LPS能够激活TLR4信号通路进而促进组蛋白甲基化转移酶PRDM9基因的表达。

丹参促进人脱落乳牙牙髓干细胞神经分化的研究

目的探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)神经分化功能的影响。方法利用不同浓度的丹参注射液和神经诱导培养基诱导SHED分化为神经元样细胞。通过观察SHED经诱导后细胞的形态变化和采用Real-Time PCR方法检测神经元标记蛋白Nestin、早期神经元标记蛋白Ⅲ-Tubulin、神经细胞粘附因子NCAM、神经分化因子Neuro D、辅助T淋巴细胞因子TH、NEF等的表达,来鉴定神经元样细胞。结果丹参注射液诱导后SHED胞体收缩,突起伸出,形似神经元;Real-Time PCR结果显示丹参注射液促进神经元标记蛋白Nestin、早期神经元标记蛋白Ⅲ-Tubulin、神经细胞粘附因子NCAM、神经分化因子Neuro D、NEF的表达。丹参注射液联合神经培养基诱导SHED神经分化的最佳丹参注射液浓度为50mg/ml。结论中药丹参在一定浓度范围内可促进SHED向神经元样细胞分化。

BCOR基因敲除促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究BCL6共抑制因子-BCOR对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法利用慢病毒载体的BCOR shRNA基因敲除BCOR,进行丧失性功能研究。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达,观察骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果 BCOR在牙源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表达无明显差异。基因敲除BCOR促进了骨髓间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白、骨钙素的表达。结论 BCOR基因表达降低能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,证实BCOR是骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制基因。

NFκB信号通路在炎症根尖牙乳头干细胞中的作用

目的研究NFκB信号通路在炎症条件下对根尖牙乳头干细胞的作用。方法利用TNFα和Ecoli.LPS刺激人根尖牙乳头干细胞。Western Blot检测IκBα的磷酸化及蛋白降解,采用Real-time PCR在mRNA水平检测IL6及IL8的表达。结果 10 ng/ml TNFα或500ng/ml Ecoli.LPS能诱导IκBα磷酸化及蛋白降解,并且促进NFκB的下游基因IL6及IL8的表达。结论在炎症根尖牙乳头干细胞,TNFα或LPS可以通过IκK复合体激活NFκB信号通路。NFκB信号通路的活化可能是导致炎症状态下根尖牙乳头干细胞功能损害的重要因素。

组蛋白去甲基化酶KDM4B促进根尖牙乳头干细胞中成骨和成牙本质分化

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM4B对根尖牙乳头干细胞定向分化能力的影响。方法人重组骨形成蛋白4(BMP4)刺激根尖牙乳头干细胞后检测KDM4B的表达;利用慢病毒转染过表达或者基因敲除KDM4B进行获得性或丧失性功能研究。通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、钙离子定量分析研究根尖牙乳头干细胞体外成骨和成牙本质分化能力。结果 BMP4促进根尖牙乳头干细胞KDM4B的表达。基因敲除KDM4B抑制根尖牙乳头干细胞ALP活性及体外矿化能力、促进转录因子PPAR-gamma的表达。过表达KDM4B增强根尖牙乳头干细胞ALP活性和体外矿化能力。结论组蛋白去甲基化酶KDM4B具有促进根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质分化的潜能。

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响。方法成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化。逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究。碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力。实时定量RTPCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达。过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。结论组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能。

组蛋白甲基化促进AP2a基因表达及骨髓间充质干细胞成骨分化

目的研究转录因子AP2a的组蛋白甲基化状态对骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。方法利用染色质免疫沉淀技术检测AP2a启动子甲基化状态。利用慢病毒载体的AP2a shRNA基因敲除AP2a进行丧失性功能研究。通过ALP活性、茜素红染色及钙离子定量分析研究骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果与牙源性间充质干细胞相比,AP2a在骨髓间充质干细胞中表达明显升高,AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2明显增强。基因敲除AP2a能抑制骨髓间充质干细胞ALP活性及体外矿化能力。结论 AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2升高可以促进AP2a的表达和骨髓间充质干细胞成骨分化能力。

DLX2基因促进脐带干细胞成骨分化

目的研究Distal-less homeobox 2(DLX2)对脐带干细胞成骨定向分化能力的影响。方法成骨分化诱导培养基诱导脐带干细胞体外成骨分化;逆转录病毒转染构建过表达DLX2的脐带干细胞,进行DLX2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨早期分化指标—碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR(real time reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测DLX2及成骨分化相关基因-Sp7转录因子、骨涎蛋白和骨钙素的表达。结果 qRT-PCR结果显示,DLX2在牙周膜干细胞的表达明显高于非牙源性干细胞—脐带干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞。碱性磷酸酶活性结果显示过表达DLX2明显增强脐带干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达DLX2明显增强脐带干细胞体外矿化能力;qRT-PCR结果显示过表达DLX2明显促进Sp7转录因子、骨涎蛋白和骨钙素的表达。结论 DLX2具有促进脐带干细胞体外成骨分化的潜能。

组蛋白去甲基化酶KDM2B在小鼠磨牙及颌骨发育中的时空表达

目的观察组蛋白去甲基化酶KDM2B在小鼠下颌第一磨牙及下颌骨发育过程中的时空表达模式,初步探讨其在牙齿及颌骨发育中的作用及功能。方法采用免疫组织化学方法观察KDM2B在ICR小鼠下颌磨牙及颌骨发育中的时空表达模式,并对其表达水平进行半定量分析。结果 E13天,KDM2B在成釉器中表达明显;E15～E19天,KDM2B在成釉器、牙乳头、牙囊普遍表达; P2天,KDM2B在成牙本质细胞中明显表达,在成釉细胞和牙乳头细胞内亦有表达; P14天,KDM2B在成熟的成釉细胞和近根尖区的成牙本质细胞中表达明显。在E13～E16天的过程中时,KDM2B在Meckel软骨内的表达由弱到强,在E16～E19天Meckel软骨内的表达趋于稳定,在周围的间充质细胞及新形成的骨基质内均有明显表达。结论 KDM2B可能参与早期成釉器细胞的增殖、晚期成釉细胞、成牙本质细胞的分化及釉质和牙本质基质的分泌,同时还可能与Meckel软骨细胞的退化、成骨细胞的分化以及骨基质的形成有关。