两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性研究

目的对比研究采用同样原料但以不同方法制备的两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性。方法溶胶-凝胶法制备A/W生物活性微晶玻璃(4006材料),熔融法制备多孔生物活性玻璃(45S5材料)。体外诱导分离培养及鉴定兔骨髓基质细胞(BMSCs),通过材料浸提液细胞毒性实验(MTT法)、细胞黏附实验、倒置相差显微镜、扫描电镜和环境扫描电镜比较4006材料和45S5材料对BMSCs细胞黏附和生长的影响,并探索与材料复合的最佳BMSCs细胞悬液浓度。结果 4006材料浸提液培养1 d时,其细胞活力与纯培养液间无统计学差异(P>0.05);但培养3 d后,其细胞活力低于纯培养液(P<0.01)。45S5材料浸提液培养的细胞活力明显低于纯培养液(P<0.01)。细胞与材料复合培养后,镜下见BMSCs在4006材料孔隙内贴壁生长良好,分泌基质活跃;而在45S5材料上细胞黏附生长较差。BMSCs与4006材料的黏附量随接种细胞浓度升高而升高,细胞悬液浓度为2×107个.mL-1时的细胞黏附量最高。结论溶胶-凝胶法制备的A/W生物活性微晶玻璃具有良好的生物活性和细胞相容性,具有作为骨组织工程支架材料的潜能。与其复合的细胞悬液浓度需要2×107个.mL-1或以上。

Nell-1基因修饰骨髓基质细胞复合β-磷酸三钙提升兔上颌窦底的实验研究

目的:评价Nel样I型分子(Nell-1)基因修饰骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,bMSCs)复合β-磷酸三钙提升兔上颌窦底的效果。方法:抽取兔骨髓进行bMSCs培养,体外采用腺病毒载体携带Nell-1基因(AdNell-1)及绿色荧光蛋白EGFP基因(AdEGFP)转染bMSCs,GFP表达检测转染效率、Nell-1免疫细胞化学检测目的基因的表达。碱性磷酸酶(ALP)染色、半定量检测及钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化。将基因修饰bMSCs与β-磷酸三钙颗粒复合用于兔上颌窦底提升,分别在术后2周和8周取材,HE染色,测量成骨面积,并采用SPSS11.0软件包对2组间数据进行t检验。结果:AdEGFP基因修饰组GFP表达效率可达60%～80%,Nell-1细胞化学染色显示,AdNell-1基因修饰组呈阳性表达。AdNell-1基因修饰组ALP染色及钙结节茜素红染色均高于AdEGFP基因修饰组,ALP半定量检测具有统计学差异(P<0.05)。体内实验研究中,AdNell-1基因修饰组新骨形成面积在8周时显著高于AdEGFP基因修饰组(P<0.05)。结论:采用AdNell-1基因转染兔bMSCs可促进其成骨分化,体内可促进上颌窦底提升的效果。

高浓度唑来膦酸对人成骨细胞成骨分化及凋亡影响的实验研究

目的:研究高浓度唑来膦酸对体外分离的健康人下颌骨成骨细胞的影响。方法 :体外分离培养来源于健康人下颌骨的成骨细胞,取P3代成骨细胞,用1μmol/L、5μmol/L唑来膦酸分别处理,不加药组为空白对照。以CCK8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,ALP染色及定量分析检测细胞成骨分化,荧光定量PCR检测成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达,Western免疫印迹检测OPN蛋白的表达。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:唑来膦酸处理后的成骨细胞增殖减慢,5μmol/L处理组较1μmol/L组增殖更慢。药物处理后的细胞凋亡较对照组增加,且随着药物浓度的增加,凋亡百分比显著上升。1μmol/L及5μmol/L唑来膦酸处理后的成骨细胞的成骨分化能力较对照组显著下降。荧光定量PCR结果提示,药物处理后的成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达显著降低。Western免疫印迹检测结果显示药物处理组OPN蛋白表达量显著下降。结论:高浓度唑来膦酸抑制来源于人下颌骨成骨细胞的增殖及成骨分化,促进其凋亡发生。

尼尔样-1型分子在促进骨组织再生中的作用

尼尔样-1型分子(NELL-1)是一种在颅缝早闭症早闭区高表达的新型生长因子,对骨软骨细胞系具有高度特异性,具有较强的诱导成骨细胞分化、抑制脂肪细胞成脂化等生物学功能。体内外试验均证实其具有较强的促进新骨再生能力。NELL-1蛋白既可以通过膜内骨化或软骨内骨化促进颅面部和其他部位原位骨组织再生,还可以在小鼠肌袋模型中促进骨髓基质干细胞形成新生骨。与经典的骨组织工程中应用的骨形态发生蛋白等生长因子相比较,单独使用NELL-1蛋白并不能直接诱导肌肉组织中的异位成骨,可见其高度的组织特异性。本文就NELL-1基因、NELL-1基因促进骨组织再生的机制、NELL-1基因促进骨组织再生的应用、NELL-1基因的其他作用等研究进展以及问题和展望作一综述。

硅酸钙生物陶瓷对牙髓细胞体外增殖分化的影响

目的：应用硅酸钙（CaSiO3，CS）生物陶瓷作用于人牙髓细胞（human dental pulp cells，hDPCs），研究其对hDPCs增殖及向成牙本质细胞方向分化的影响。方法：从年轻健康患者（18～20岁）拔除的智齿或前磨牙牙髓组织中获取hDPCs进行培养。将质量浓度为0．2g／mL的CS浸提液按1／2、1，4、1／8、1／16、1／32、1／64和1／128倍比稀释后作用于hDPCs。MTY实验检测不同质量浓度CS浸提液对hDPCs增殖的影响，进而筛选出最佳浓度。以最佳质量浓度（1／64倍比稀释）CS浸提液培养hDPCs2、4d后，Real．TimePCR检测以下hDPCs成牙本质相关基因的表达：牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein，DSPP）、牙本质基质蛋白－1（dentin matrix protein1，DMP．1），I型胶原（collagen tvpeI，COL-I）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）；培养7、14d后碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色及半定量检测ALP活性。结果：最佳质量浓度（1／64倍比稀释）cs浸提液能够促进hDPCs的增殖，对牙髓细胞DSPP、DMP-1、COL-1、OPN等成牙本质相关基因的表达有较为明显的促进作用。ALP染色及半定量分析显示该浓度的CS浸提液能够提高hDPCs分泌ALP的活性。结论：最佳质量浓度（1／64倍比稀释）CS浸提液能够明显促进hDPCs的增殖，提高成牙本质相关基因的表达，进而促进hDPCs向成牙本质细胞方向分化，为后期hDPCs结合CS支架材料进行牙本质再生的研究打下基础。

TiO_2纳米管负载聚六亚甲基胍促进种植体钛表面成骨分化性能的研究

目的研究聚六亚甲基胍对体外培养大鼠骨髓基质干细胞增殖和成骨性分化的影响,探索Ti O2纳米管负载聚六亚甲基胍对种植体钛表面是否具有促成骨分化能力。方法将1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5kg/L浓度的聚六亚甲基胍盐酸盐溶液分别作用于大鼠骨髓基质干细胞,采用MTT法分析细胞增殖情况。在不加成骨诱导液培养条件下比较聚六亚甲基胍作用组和不加药对照组碱性磷酸酶染色强弱,采用实时荧光定量PCR分析成骨性分化标志基因表达差异。将聚六亚甲基胍负载到Ti O2纳米管修饰种植体钛表面后和单纯Ti O2纳米管修饰种植体钛表面组、酸洗微米级粗糙种植体钛表面组实时荧光定量PCR分析成骨性分化标志基因表达差异。结果聚六亚甲基胍无明显促进细胞增殖能力,1×10-6kg/L浓度下能够促进大鼠骨髓基质干细胞的成骨性分化,将聚六亚甲基胍以1×10-5kg/L的浓度负载到Ti O2纳米管后,显著提高了种植体钛表面的促成骨分化能力。结论 Ti O2纳米管负载聚六亚甲基胍能够促进种植体钛表面成骨性分化,具有潜在的促进骨结合作用。

去卵巢骨质疏松大鼠拔牙创模型研究

目的通过卵巢切除术及大鼠左侧上颌第一磨牙拔除术建立去卵巢骨质疏松大鼠拔牙创模型。方法选用3个月龄雌性SD大鼠24只,随机分为模型组、对照组,每组12只,卵巢切除术2个月后对两组大鼠行左侧上颌第一磨牙拔除术,于卵巢切除术后2个月及拔牙术后第2、4、8周分4批处死大鼠,通过体质量、血清生化检测、Micro-CT检测及组织学观察对动物模型进行评价。结果卵巢切除术前模型组体质量((300.52±5.94)g)与对照组((298.88±6.21)g)相比无显著差异;术后2个月,模型组((355.64±12.09)g)相比于对照组((328.30±10.03)g)体质量明显增加(P<0.05)。卵巢切除术后2个月模型组雌二醇水平((10.21±4.35)pg/m L)较对照组((22.49±2.94)pg/m L)明显降低(P<0.05),同时模型组大鼠股骨远端骨小梁较为稀疏不连续。Micro-CT示拔牙术后(4周(0.113 8±0.009 9)mm,8周(0.122 7±0.019 7)mm)模型组骨小梁厚度均明显低于对照组(4周(0.142 3±0.010 6)mm,8周(0.201 3±0.052 7)mm)(P<0.05)。组织学观察显示拔牙术后模型组拔牙创骨小梁纤细,稀疏,不规则,骨量少,新骨愈合质量降低。结论采用卵巢切除术结合大鼠左侧上颌第一磨牙拔除术可建立去卵巢骨质疏松大鼠拔牙创模型,为探讨绝经后骨质疏松对拔牙创愈合的影响及其机制提供了有效的手段。

载辛伐他汀β-磷酸三钙支架复合脂肪干细胞修复兔颅骨缺损

目的:应用辛伐他汀(simvastatin)作用于脂肪干细胞,研究其对细胞生长、成骨、成血管分化的影响;利用β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)三维支架材料负载辛伐他汀,与脂肪干细胞复合,构建组织工程骨,用于兔颅骨缺损模型的修复。方法:原代培养兔脂肪干细胞(rabbit adipose-derived stem cells,rASCs),分别以含0、0.01、0.1和1μmol/L辛伐他汀的培养液培养,计数法检测细胞数目;以0、0.05、0.1μmol/L浓度辛伐他汀培养ASCs,1、7 d后,实时定量PCR检测成骨、成血管基因的表达(RUNX2、OPN、OCN、VEGF);7 d后行ALP染色;14 d后行茜素红染色。12只新西兰大白兔颅顶双侧8 mm缺损,分别以4组材料修复(A:β-TCP,B:β-TCP/Cell,C:β-TCP/Sim,D:β-TCP/Cell/Sim),每组6例,植入8周后取材,进行组织学观察。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:0.05μmol/L辛伐他汀对脂肪干细胞RUNX2、OCN、OPN和VEGF等成骨、成血管基因的表达具有明显促进作用,碱性磷酸酶染色和von Kossa染色更为明显;植入体内8周后,β-TCP/Cell/Sim组材料的成骨面积显著大于其他3组。结论:0.05μmol/L辛伐他汀在体外对ASCs具有明显的促成骨作用,载辛伐他汀β-TCP复合脂肪干细胞可促进兔颅骨缺损的修复。

含锶锌黄长石涂层钛表面促进骨髓间充质干细胞成骨分化的初步研究

目的钛合金表面制备新型含锶锌黄长石(Sr-Ca_2ZnSi_2O_7,Sr-HT)涂层,初步评估其对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨分化等生物学行为的调控能力,用于指导新型种植体设计以促进骨结合效果。方法采用等离子喷涂法对钛合金表面进行Sr-HT涂层修饰,分别以锌黄长石(Ca_2ZnSi_2O_2,HT)以及羟磷灰石(HAp)涂层钛表面作为对照。扫描电镜观察涂层的表面结构,并使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测表面涂层的离子释放情况。原代培养犬骨髓间充质干细胞(BMMSCs)并接种于材料表面,用免疫荧光法观察细胞在三种涂层表面的粘附铺展情况,ALP半定量检测和OCN蛋白表达免疫荧光法观察细胞在三种涂层表面的成骨分化情况。结果扫描电镜下观察,三种涂层表面均为凸凹不平的微米尺度结构,与HAp涂层相比,Sr-HT和HT组浸提液中含有锌离子,Sr-HT涂层还能够释放大量锶离子。BMMSCs在Sr-HT和HT涂层表面粘附能力、ALP活性和OCN蛋白表达均显著高于HAp对照组,其中Sr-HT组更明显。结论与传统HAp涂层相比,新型Sr-HT涂层可促进BMMSCs的粘附和成骨分化,其促进成骨分化的作用与Zn和Sr离子释放有关。