hsa-miR-125a的靶基因预测及生物信息学分析

目的:通过生物信息学分析方法预测hsa-miR-125a的靶基因并对靶基因进行GO、KEGG富集分析。方法:利用miRBase数据库分析hsa-miR-125a的物种保守性;利用TargetScan、miRTarBase、miRDB数据库预测hsa-miR-125a靶基因,再将预测的靶基因利用DAVID数据库进行基因本体(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)生物通路富集分析。结果:hsa-miR-125a预测的交集靶基因共有122个。GO富集分析结果显示,hsa-miR-125a的靶基因主要参与细胞对DNA损伤刺激的反应、蛋白质泛素化的正调控等生物过程(均P<0.01)。KEGG信号通路富集分析结果显示,hsa-miR-125a的靶基因显著富集于endocytosis signaling pathway、adherens junction signaling pathway、TGF-βsignaling pathway、HIF-1 signaling pathway(P<0.05)。结论:hsa-miR-125a的靶基因富集的信号通路与破骨细胞生成密切相关,尤其是TGF-βsignaling pathway。

骨质疏松差异miRNA表达及靶基因分析

目的通过GEO数据库分析骨质疏松患者血清及髋骨组织中差异miRNA的表达变化,并对差异miRNA的靶基因进行GO、KEGG功能富集分析、转录因子预测和蛋白网络调控图绘制,探讨这些差异基因在疾病发生、发展过程中的作用,为研究骨质疏松的发病机制、治疗及预防骨质疏松性骨折提供依据。方法下载GEO数据库中的骨质疏松差异miRNA数据集作为研究对象,第一组为GSE91033数据集,包括1例正常对照组和2例骨质疏松患者的血清miRNA表达谱;第二组为GSE74209数据集,包括6例正常对照组和6例骨质疏松患者髋骨组织miRNA表达谱。使用GEO数据库中GEO2R分析工具,筛选两组数据中调整后P<0.05,logFC>1或logFC<-1的差异miRNA作为研究对象。通过SangerBox工具绘制差异miRNA火山图,TargetScan数据库预测差异miRNA的靶基因,FunRich软件、DAVID在线数据库对靶基因进行GO、KEGG功能富集分析、转录因子预测,最后使用Cytoscape软件进行蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)蛋白网络调控图绘制并确定核心蛋白。结果在GSE91033数据集中,筛选出骨质疏松患者外周血中有204个差异miRNA(164个上调miRNA,40个下调miRNA);在GSE74209数据集中,筛选出骨质疏松患者髋骨组织中有138个差异miRNA(39个上调miRNA,99个下调miRNA)。通过GO、KEGG功能富集分析,得到GO生物过程包括三酰甘油合成过程、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激的反应、成纤维细胞迁徙的正向调控、骨重建等。KEGG富集分析得到缺氧诱导因子(HIF)-1信号通路、细胞外基质(ECM)受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、E-钙黏蛋白(cadherin)信号通路等。通过cytohubba插件分析得到20个关键基因(Hub),其中处于枢纽地位的有丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、着丝粒相关蛋白(DSN)1、UBE203三个基因。结论骨质疏松患者外周血和骨组织有多个上调的差异miRNA,这些上调的差异miRNA可能通过靶向枢纽基因MAPK1、DSN1、UBE203经多种途径参与骨质疏松的进程。

破骨细胞建模方法的探索

目的探索RAW264.7细胞向破骨细胞分化的最佳条件,为后续的实验研究提供一个可靠的破骨细胞建模方式。方法将RAW264.7细胞以每孔2×10^(4)个、每孔3×10^(3)个分别接种到6孔板、24孔板中,待贴壁24 h后更换为含20 ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、50 ng/ml的核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的诱导液诱导培养,每隔2 d换液一次,待镜下观察到较多破骨细胞时进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并利用实时荧光定量PCR检测活化T-细胞核因子1(NFATc1)、TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的mRNA表达水平。结果经过诱导培养3 d时破骨细胞开始聚集生长,出现多个核,但整体阳性破骨细胞不是太多,待诱导至4~6 d时,可见到较大面积的破骨细胞,细胞核增多达数十个,细胞质也非常丰富;与对照组相比,诱导组NFATc1、TRAP、MMP-9的mRNA表达水平上调。NFATc1、MMP-9与对照组的差异有统计学意义(P<0.05),但是TRAP与对照组的差异没有统计学意义。结论RAW264.7细胞在20 ng/ml的M-CSF、50 ng/ml的RANKL这两种细胞因子存在的条件下经过4~6 d培养可以被诱导为破骨细胞。

氯化钴诱导破骨细胞体外缺氧模型的建立

观察氯化钴( CoCl2 )对体外培养的破骨细胞的影响,探索合适的体外化学模拟缺氧模型。方法 用20ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、50ng/ml核因子κB受体激活因子配体(RANKL)诱导培养RAW264.7细胞。通过TRAP染色鉴定破骨细胞,然后用不同浓度CoCl2处理,观察细胞活力水平,Western blot和qRT-PCR检测破骨细胞中低氧诱导因子1α(HIF 1α)的蛋白及mRNA表达。结果 100、200、300、400μmol/L的CoCl2浓度可促进破骨细胞增殖(P < 0.05),而超过500μmol/L的CoCl2浓度降低破骨细胞的细胞活力;100μmol/LCoCl2浓度刺激24h后,HIF 1α蛋白及mRNA表达显著上调。结论 CoCl2对破骨细胞的增殖与浓度有关;100μmol/LCoCl2可建立体外培养破骨细胞缺氧诱导模型。