水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了对水貂肠炎病毒(MEV)疫苗免疫后抗体水平的监测和疫苗免疫效力的评价,本研究在分析MEV VP2蛋白抗原性的基础上,设计1对特异性引物克隆VP2蛋白抗原性较好的基因片段,将克隆的基因片段定向插入到pProEXHTb原核表达载体中,构建了VP2基因原核表达重组质粒pProEXHTb-VP2A,并实现在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,经鉴定表达的重组蛋白以包涵体形式存在,免疫印迹试验表明获得的重组蛋白具有与抗体较好的反应原性。应用His·Bind亲和层析柱纯化重组蛋白VP2A,以纯化后的重组蛋白作为ELISA诊断抗原,并对反应条件进行优化,初步建立了检测MEV抗体的VP2A-ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为9.65μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶10。判定标准为S/P值≥0.312为阳性,S/P值≤0.243为阴性,介于两者之间为疑似。该抗原不与犬瘟热病毒、阿留申病毒阳性血清反应,具有良好的特异性。采用VP2A-ELISA对180份水貂血清样品进行检测,结果显示VP2A-ELISA与HI试验的符合率达到87.8%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为现地免疫貂群抗体检测和MEV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

水貂犬瘟热CDV_3疫苗株基因组序列测定及H基因遗传稳定性分析

对水貂犬瘟热CDV3疫苗株基因组进行全序列测定与分析，以阐明该疫苗株的来源亲本毒株，基因特征及H基因遗传稳定性。将CDV3疫苗株基因组cDNA分9个重叠片段进行RT-PCR并克隆入pMD 18-T载体中，测定全长cDNA序列。并与CDV野毒参考株和疫苗株N、F和H基因氨基酸序列比对分析其基因变异情况。通过对CDV3疫苗株6个不同生产批次（Veto细胞培养代次）H基因序列测定以分析毒株的分子遗传稳定性。基因序列分析结果表明：CDV3疫苗株基因组全长15690bp，与CDV野毒株基因组同源性较低（93．0％～95．3％）。H基因核苷酸和氨基酸序列与Lederle疫苗株（EF418783）同源性最高，分别为99．6％和98．7％。而6个不同培养代次CDV3疫苗株H基因氨基酸序列无任何差异。由此证实CDV3疫苗株的亲本毒株与Lederle疫苗株有着最密切关系，不同培养代次的CDV3疫苗株H基因具有较高的遗传稳定性。