植物生物反应器的研究进展

利用植物生物反应器生产外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统,以下介绍了植物生物反应器的不同表达系统,及其各个系统的发展进程和研究现状等。重点论述了应用植物各大表达系统生产疫苗、抗体和医用蛋白等方面的情况以及本实验室在这一领域的研究情况。随着该领域研究的进展,植物生物反应器用于生产低成本药用蛋白的产业化将显示出越来越良好的发展前景。

融和蛋白GST-SUMO-MT在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

将编码融合蛋白GST-SUMO-MT的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-GS-MT并转化到大肠杆菌Origami(DE3)中。20℃,1mmol/L的IPTG诱导20h后,获得分子量约为43kDa的融合蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的38.4%。利用谷胱甘肽交联琼脂糖(glutathionesepharose4B)凝胶柱和SephardexG-25分子筛联用可以得到纯度为95%以上的融合蛋白,得率约为70mg/L。该融合蛋白可与GST抗体产生阳性反应。融合蛋白GST-SUMO-MT可以显著提高宿主对Cd2+、Zn2+和Cu2+离子聚积的能力,其耐受能力比对照组分别提高4.2倍、4倍及1.6倍。此外,原子吸收光谱法测定,每分子GST-SUMO-MT可以结合2～3个Cd2+离子。

山慈菇提取物抑制血管形成的药效学研究

本研究采用MTT法考察山慈菇提取物对人脐静脉细胞株(HUVEC)增殖的影响,并以此为依据对山慈菇提取物进行活性跟踪分离,运用鸡胚尿囊膜血管生成模型分析山慈菇提取物对新生血管的影响。山慈菇提取物具有明显的抑制HUVEC增殖活性,同时具有抑制CAM血管新生成的作用,尤以山慈菇乙酸乙酯层(氯仿—甲醇)梯度洗脱的F1B提取物活性最佳。得出提示山慈菇提取物具有明显抑制血管生成作用,有可能成为血管生成抑制剂。

丙烯酰胺和细胞松弛素D作用下大鼠肝细胞中黏弹性的研究

采用微管吮吸技术测定了大鼠肝细胞的黏弹性,进一步研究了丙烯酰胺(acrylamide)和细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)以及两者混合作用后对于细胞黏弹性的影响。结果表明:在用CD、丙烯酰胺以及CD、丙烯酰胺混合处理细胞后发现细胞的黏弹性系数均明显下降。尤其是对K1的影响最大中间纤维对于黏弹性系数K1的影响要大于微丝对K1影响。而微丝于黏弹性系数K2的影响要大于中间纤维对K1的影响。另外在丙烯酰胺和细胞松弛素D两者混合作用后细胞的黏弹性系数均比两者单独使用时呈显著下降的趋势。提示中间纤维、微丝在维持细胞黏弹性这一生物力学特性方面均起着一定的作用。另外从以丙烯酰胺组和细胞松弛素D组为照组的数据中发现:丙烯酰胺和细胞松弛素D两者混合作用后细胞的黏弹性系数K1或K2也存在一定程度的降低。中间纤维和微丝可能对正常肝细胞黏弹性有一定之间的交互影响的作用。

掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯-D的抗炎和抗过敏作用研究

本文旨在研究掌叶蜂斗菜提物取物对过敏反应及炎症的影响,为其临床治疗过敏性哮喘提供药理学依据。主要通过硅胶柱色谱技术从掌叶蜂斗菜叶片中得到蜂斗菜内酯-D;采用抗原诱导的RBL-2H3细胞活化脱颗粒模型,测定蜂斗菜内酯-D对β-HEX的影响;通过OVA诱导和激发BALB/c小鼠,构建哮喘小鼠模型,并对支气管灌洗液(BALF)中炎症细胞计数和分类计数,观察蜂斗菜内酯-D的抗过敏、抗炎作用。结果表明0.1-10ug/ml蜂斗菜内酯-D对β-HEX抑制率分别为26.82%、34.1%、44.25%、61.32%,可见蜂斗菜内酯-D在此剂量内能够较明显抑制抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放,抑制率与浓度相关;通过分析BALF中炎症细胞的数量,蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比,能有效抑制BALF中炎症细胞的数量(P<0.01)。蜂斗菜内酯-D具有良好的抗炎、抗过敏作用,可以用来治疗过敏性哮喘疾病。

SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定

利用PCR技术人工合成编码酿酒酵母泛素样特异性蛋白酶1(Ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段Ulp1p,并连接到大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-Ulp1p。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。经IPTG诱导4h后,SDS-PAGE结果显示,Ulp1p为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的50.8%。通过Ni-NTA凝胶亲和层析和G-25凝胶层析联用可以获得纯度大于95%的Ulp1p。Western blotting分析表明,Ulp1p能与6xHis抗体产生免疫反应。以重组蛋白SUMO-hEGF(人表皮生长因子)和GST-SUMO-MT(金属硫蛋白)为底物进行酶切分析,结果显示,Ulp1p能特异性水解这两种SUMO融合蛋白,其比活为1.386×104U/mg。

植物激素对红花再生体系的影响(英文)

目的:研究植物激素对红花再生植株的影响,为红花的良种快速繁殖、遗传转化等研究提供基础。方法:以红花无菌苗的子叶作为外植体,研究了植物激素对红花愈伤组织诱导、分化和生根的影响。结果:1.不同激素单独使用均能诱导出愈伤组织,但没有直接产生不定芽;2.不同植物激素配合使用对不定芽的分化率明显不同,生根情况也存在差异显著;3.子叶愈伤组织诱导培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+1.0 mg/L NAA;分化培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L6-BA;生根培养基:1/4 MS+2.0 mg/L NAA+0.5mg/L IAA。结论:通过单一激素与两激素配合使用,筛选出愈伤组织诱导、分化和组培苗生根的最佳培养基。

温郁金愈伤组织培养及快速繁殖

为了提纯复壮温郁金资源,快速繁殖良种苗木,满足市场供不应求的现状,对温郁金外植体培养及愈伤组织的诱导、继代、分化和再生进行研究。结果表明:莪术外植体在以MS培养基为基本培养基,附加6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L适于丛生芽的诱导与增殖;附加2,4-D2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L适于愈伤组织的诱导;附加2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L适于愈伤组织的继代培养;附加KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L适于愈伤组织的分化,生根的最佳培养基为MS+IAA 1.0 mg/L。因此,可以通过组织培养的方式提纯复壮温郁金资源,进行温郁金的快速繁殖。

温度对不同发育阶段东亚飞蝗酚氧化酶活性的影响

为比较昆虫发育时期免疫防御能力的强弱，对不同发育时期东亚飞蝗体外酚氧化酶活性的动态变化进行了测定和比较分析。结果显示：从东亚飞蝗不同发育时期看，1-5龄蝗蝻及雄成虫25°C时酚氧化酶活性达到峰值，雌成虫30℃时酚氧化酶活性达到峰值，雌虫酶活性高于雄虫；不同温度作用下，l～5龄蝗蝻在15～45℃温度变化中变化规律相似，1龄蝗蝻酶活性最低，2-4龄蝗蝻时期酶活性升高，5龄蝗蝻时酶活性达到峰值，成虫酶活性在30℃和45℃时，雌虫酶活性高于雄虫（P〈0．05）。东亚飞蝗不同发育时期、不同温度作用下酚氧化酶活性动态变化显示了其免疫能力的强弱差异。

RAPD技术在东北地区玉米品种鉴别上的应用

应用现代分子生物学RAPD技术,对吉林省主推6个玉米杂交种及其父母本的指纹图谱进行鉴别.在30个随机引物中选出扩增效果明显、特异性高的引物R1和R2并对18份材料进行基因图谱的分析,图谱差异显著、易于区分,说明RAPD技术可用于玉米品种鉴定和纯度鉴定.

红花遗传转化受体系统的建立及转酸性成纤维细胞生长因子aFGF的初步研究

目的:将aFGF与红花的油体蛋白融合,转入红花中,直接通过提取红花油来实现红花与aFGF的双重功效。方法:以不同日龄的红花子叶为外植体,采取正交试验设计的方法,摸索出红花再生体系的最佳条件。然后通过农杆菌介导法将aFGF基因转入到红花中,对不同浓度的抗生素进行筛选,进行PCR鉴定,计算阳性率。结果:根据不同的激素配比,确定了红花分化的最佳培养基为MS+BA1.0 mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1;生根的最适培养基为1/4 MS+NAA2.0 mg.L-1+IAA0.5 mg.L-1。3种不同种类和浓度的抑菌抗生素对红花浸染后的抑菌效果略有不同,结合抑菌效果,污染率,芽的分化率以及成本问题等因素的综合考虑,抑菌抗生素选择用Tim,质量浓度为400 mg.L-1即可抑制细菌的生长,同时有利于芽的分化;hyg的筛选压力则选择6 mg.L-1为它的临界浓度;对8棵转化植株进行鉴定,阳性率为25%。结论:通过器官发生途径,确定出红花分化与生根的最佳激素组合与配比,建立了红花的再生体系;确定出最适的抑菌抗生素与筛选抗生素的浓度;经过筛选获得的再生植株,通过PCR检测,部分扩增出aFGF目的基因,证实了aFGF基因整合到红花基因组中。这为红花作为植物生物反应器的研究奠定了扎实的基础。

利用红花瞬时表达aFGF-GFP融合基因的研究

目的:利用红花表达aFGF可以使aFGF的组织创伤修复的活性和红花的活血通经、散瘀止痛以及跌打损伤等功效累加,直接用于外伤修复。方法:利用分子生物学方法构建aFGF与GFP的融合基因载体,通过农杆菌介导法将其转化到红花中,形成抗性红花愈伤组织后,利用荧光显微镜进行检测。结果:通过PCR分别扩增了aFGF和GFP基因片段,确定出PCR反应体系和最佳反应条件,合成了融合基因片段aFGF-GFP,成功构建了植物荧光表达载体pCAMBIA1390::35S::aFGF-GFP,用其转化红花,获得的抗性愈伤组织在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光。结论:抗性红花愈伤组织中的GFP表达效果良好,初步判断aFGF基因在植物细胞中也已经表达。

猪瘟表面抗原E2-Erns蛋白在亚麻芥种子中的表达及活性分析

猪瘟病毒能导致猪的高度接触性传染病,对养猪业危害极大。由于传统猪瘟疫苗在使用及生产中存在诸多不足,促使科研工作者研制开发新型猪瘟疫苗。猪瘟病毒主要保护性抗原是E2蛋白和Erns蛋白,能够引起机体的免疫反应。植物表达体系具有表达效果好和生产成本低等优点,随着近些年开始出现利用转基因植物生产蛋白产品的技术,植物生物反应器越来越引起广泛关注。植物生物反应器具有完整的真核细胞表达系统,能够进行准确的蛋白翻译后加工,能较好的保留蛋白生物活性。为利用转基因植物生物反应器制备猪瘟的亚单位可饲疫苗及其商品化提供实验依据,本研究拟构建种子特异性启动子驱动的目的基因的表达载体,并转导至亚麻芥生物反应器中,表达猪瘟病毒E2-Erns融合蛋白。利用表达的猪瘟病毒E2-Erns蛋白以口服接种的方式进行小鼠模型的免疫实验,验证目标蛋白的抗原性。

胡椒薄荷叶挥发油化学成分及活性分析

目的:研究胡椒薄荷Mentha piperita叶挥发油的化学成分及其生物活性,为胡椒薄荷资源的开发利用奠定基础。方法:采用超临界CO_2萃取法提取叶片挥发油,通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析其化学成分,分别采用DPPH法和卤虫幼体研究其抗氧化活性及生物毒性,纸片扩散法及埃及伊蚊幼虫毒杀法评价其抗菌活性和杀虫活性。结果:用超临界CO_2萃取法提取得到的挥发油得率为0.089%,从中鉴定了11个化学成分,已鉴定出的组分占挥发油总量的93.0%,其中芳樟醇占总挥发油的49.9%,可以认为是其主要成分;挥发油对DPPH的半数抑制浓度(IC50)0.45 g·L^(-1),对卤虫幼体的半数致死浓度(LC50)526.0 mg·L^(-1);在挥发油质量浓度为10 g·L^(-1)时,对大肠埃希菌抑菌圈直径为(9±1)mm,对金黄色葡萄球菌效果不明显;对埃及伊蚊的LC50339.6 mg·L^(-1)。结论:胡椒薄荷叶挥发油对大肠埃希菌有一定的抑制作用,在抗氧化及杀虫方面具有一定活性,但是相对较弱,不宜用于杀虫剂产品开发;此外,胡椒薄荷叶挥发油具有弱的生物毒性。本研究为胡椒薄荷的开发利用提供了科学依据。

VP7-CTB融合蛋白在拟南芥种子中的表达及免疫原性分析

为了研发植物来源的轮状病毒疫苗,采用模式植物拟南芥作为生物反应器,将轮状病毒主要中和抗原基因VP7融合CTB,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得了含有VP7-CTB的转基因拟南芥稳定株系,并分析其种子表达蛋白的免疫原性。首先,根据拟南芥密码子的偏好性,设计合成优化的VP7和CTB基因,构建植物表达载体pPHAP1301-his-VP7-linker-CTB;再通过农杆菌介导的Floral Dip法转化拟南芥,收获T0代种子后播种,喷用草铵膦筛选转基因拟南芥获得T1代种子,重复上述过程最终获得T3代拟南芥种子,通过RT-PCR、W estern-bolt、ELISA等进行分析。结果表明,his-VP7-linker-CTB基因已成功整合到拟南芥的基因组并进行了转录和蛋白表达,并且VP7蛋白占总可溶性蛋白的0.39%,即转基因拟南芥种子中所含目的蛋白为52.65 g/g。最后,用转基因拟南芥稳定株系种子中的可溶性蛋白口服免疫小鼠,使小鼠获得免疫原性;乳鼠攻毒试验证明,母鼠免疫后产生的抗体能够有效传递给子代,具有很好的保护作用。

轮状病毒外壳蛋白VP7基因在拟南芥种子中表达及免疫原性分析

为了研究开发植物来源的轮状病毒疫苗,试验采用模式植物拟南芥作为生物反应器,将轮状病毒主要中和抗原基因VP7通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得了含有VP7的转基因拟南芥稳定株系,并分析其种子表达蛋白的免疫原性。首先根据拟南芥密码子的偏好性,设计合成优化的VP7基因,构建植物表达载体p PHAP1301-His-HRVVP7;然后通过农杆菌介导的Floral Dip法转化拟南芥,收获T0代种子后播种,喷用草铵膦筛选转基因拟南芥获得T1代种子,重复上述过程最终获得T3代拟南芥种子,通过RT-PCR、Western、ELISA法等进行分析。结果表明:VP7基因已成功整合到拟南芥的基因组并进行了转录和蛋白表达,并且VP7蛋白占总可溶性蛋白的0.31%,即每克转基因拟南芥种子中所含目的蛋白为43.3μg。以转基因拟南芥稳定株系种子中的可溶性蛋白口服免疫小鼠,可使小鼠获得免疫原性。说明通过植物作为生物反应器生产轮状病毒疫苗方法可行。