人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建

鲨烯合酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SE)是人参皂苷生物合成过程中的关键酶。以五年生人参叶片为供试材料提取总RNA,根据GeneBank上已发布的SQS和SE基因登录号(AB010148和AB122078),查找对应序列并设计特异性引物,运用RT-PCR方法,通过构建pMD18-T重组质粒、测序分析,成功克隆到大小分别为1440bp的SQS基因和1780bp的SE基因。同时还构建了这2个基因的表达载体pCAMBIA1301-SQS和pCAMBIA1301-SE,从而为分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用提供试验材料。

人参SQE基因干扰载体的构建及转化

目的探讨SQE基因对人参皂苷合成的影响。方法根据SQE基因保守区序列,分别设计合成其正反义片段引物行RT-PCR扩增,扩增产物分别与pMD18-T质粒连接后转化E.coli DH5α,获得的pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A重组质粒经双酶切后,将正反义片段与质粒pMHZ112反向连接,转化E.coli DH5α,构建SQE基因RNAi双元表达载体pMHZ112-SQE。电击法将鉴定正确的重组质粒pMHZ112-SQE转化农杆菌GV3101感受态细胞,再利用农杆菌介导法转化人参愈伤组织,提取抗性人参愈伤组织细胞基因组DNA,进行PCR检测并计算抗性愈伤转化率;同时提取人参皂苷,采用HPLC方法检测抗性人参愈伤组织的皂苷含量。结果结果显示总RNA较完整无降解,质量较好;RT-PCR扩增产物正反义片段大小与预期一致;重组质粒pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A和pMHZ112-SQE分别经双酶切进行测序鉴定,结果表明目的基因已插入重组质粒且连接方向正确。人参愈伤组织细胞基因组DNA的PCR检测结果显示1个菌落经2对引物扩增结果均呈阳性,证明构建的pMHZ112-SQE重组质粒已成功整合入植物基因组中,其抗性愈伤转化率为1%。转化pMHZ112-SQE重组质粒后,人参抗性愈伤组织中单体皂苷Rg1、Re、Rc含量明显下降,Rb1略有升高,实验组与对照组(转化空质粒)间Rg1、Re、Rb1、Rc的含量差异显著(均P<0.05);而2组均未检测出Rb2和Rd。结论成功构建了SQE基因RNAi双元表达载体,通过转化人参愈伤组织抑制SQE基因的表达,可以调控人参皂苷含量发生相应的改变。

RNAi干扰的F3H基因转化大豆的研究

利用根据RNAi技术构建的干扰黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)的载体pF3Hi330,通过农杆菌介导辅助抽真空的大豆茎尖转化法和花粉管通道法将pF3Hi330载体整合到大豆基因组中,获得转基因阳性植株4棵,抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到大豆基因组中。同时,对转基因阳性植株异黄酮含量进行测定,显示异黄酮含量得到一定的提高。结果表明更多的前体流向异黄酮合成的分支途径,达到提高大豆异黄酮含量的目的。