Egr1介导的人截短型凋亡诱导因子表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律

目的:克隆人截短型凋亡诱导因子(AIF)cDNA序列,并构建早期生长反应因子1(Egr1)介导的重组表达载体pcDNA3.1-Egr1-AIFΔ1-480(pEgr1-AIFΔ1-480),观察其在人乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律。方法:以人白血病Jurkat细胞mRNA为模板,RT-PCR法扩增获得人AIFΔ1-480,与pMD18T载体连接后行全自动测序,限制性内切酶切取pMD19T-Egr1中Egr1片段,并利用基因重组技术构建Egr1启动子介导的人AIFΔ1-480表达质粒pEgr1-AIFΔ1-480。实验分为对照组、pcDNA3.1组、pAIFΔ1-480组和pEgr1-AIFΔ1-480组。各组质粒分别转染MCF-7细胞,Western blotting法检测AIF及AIFΔ1-480蛋白的辐射诱导表达时程-效应(2.0Gy照射后0、2、4、12、24和48h)和剂量-效应(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0Gy照射后24h)规律。结果:经测序证实,RT-PCR获得的人AIFΔ1-480基因与预期一致,pEgr1-AIFΔ1-480经PCR和酶切鉴定完全正确;各组MCF-7细胞经2.0Gy照射后0～48h,AIF蛋白在各组中均有表达,从4h开始显著增加,4、12、24和48h各组AIF表达与0h组比较差异有统计学意义(P<0.05),48h达到最大;而在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组,AIFΔ1-480从2h开始表达,4、12、28和48h各组AIFΔ1-480表达与2h比较差异有统计学意义(P<0.05),24h达到峰值;而且24和48h时pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达较pAIFΔ1-480组显著增加(P<0.05)。各组MCF-7细胞经0～5.0Gy照射后24h,各组均有AIF蛋白表达,而AIFΔ1-480只在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组表达,二者均随着剂量增加而增加,0.2、0.5、1.0、2.0和5.0Gy照射后各组AIF表达与0Gy比较差异有统计学意义(P<0.05),在5.0Gy照射时达到最大,相同照射剂量pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达高于pAIFΔ1-480组。结论:成功构建Egr1介导的人截短型AIF重组表达载体pEgr1-AIFΔ1-480,AIF和AIFΔ1-480蛋白在MCF-7细胞中的表达随照射时间延长和照射剂量增加而增加。

电离辐射对乳腺癌干细胞活性氧、凋亡和细胞周期的影响

目的：研究电离辐射对乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞活性氧（ROS）、凋亡和周期分布的影响，探讨乳腺癌干细胞辐射抵抗产生的机制。方法：采用含多种生长因子的无血清培养基悬浮培养人乳腺癌 MCF-7细胞系，分为乳腺癌细胞 MCF-7组、乳腺癌干细胞 MCF-7-S组、MCF-7＋8 Gy组和 MCF-7-S＋8 Gy组。8 Gy电离辐射后4～24 h，分别采用2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）、AnnexinⅤ-FITC/PI和 PI染色，流式细胞术检测细胞中 ROS水平、凋亡细胞百分比和各细胞周期时相细胞百分比。结果：含多种生长因子无血清悬浮培养7 d后，形成数百个细胞聚集而成的乳腺癌干细胞微球；流式细胞术检测， CD4＋＋CD24－表型的乳腺癌干细胞高达75.20％。随着时间的延长，MCF-7组和 MCF-7-S组细胞中 ROS水平和细胞凋亡均呈增加的趋势，在12和24 h 达到较大值；在4、8、12和24 h时，MCF-7-S组细胞中 ROS水平均低于 MCF-7组（P＜0.05或P＜0.01）， MCF-7-S组凋亡细胞百分比只在8 h显著高于 MCF-7组细胞（P＜0.05）；MCF-7＋8 Gy组细胞中 ROS水平（4、8、12和24 h）和凋亡细胞百分比（12 h）显著增加（P＜0.05），MCF-7-S＋8 Gy组凋亡细胞百分比（4、8、12和24 h）显著降低（P＜0.05或P＜0.01），MCF-7-S＋8 Gy组细胞中 ROS水平无明显变化。在12 h时，与MCF-7组比较， MCF-7-S组细胞 G0/G1期和 G2/M期细胞百分比显著降低（P＜0.05）， S期细胞百分比显著增加（P＜0.05）；MCF-7＋8 Gy组细胞 G2/M期细胞百分比显著增加（P＜0.05），而 MCF-7-S＋8 Gy组无明显变化。结论：电离辐射导致 MCF-7中 ROS水平和凋亡增加， G2/M期阻滞，而对 MCF-7-S则无明显影响，提示MCF-7-S辐射抵抗可能与 ROS水平、细胞凋亡和 G2/M期阻滞有关。

口腔数字化曲面断层机与普通曲面断层机受照剂量对比研究

目的:比较使用普通曲面断层机及数字化曲面断层机完成同样医疗任务的情况下的患者实际受照剂量,为临床选择口腔X线检查方法提供依据。方法:将50个圆片状氟化锂热释光剂量计(简称剂量计)平均分成5组:第1组剂量计放于医生办公室,作为天然本底对照组,其余4组剂量计分别按照临床普通曲面断层机和数字化曲面断层机对儿童及成人的口腔疾病进行照射的条件照射,照射后用热释光剂量仪对以上各组剂量计计数,计算出受照剂量,并进行统计学分析。结果:儿童和成人使用普通曲面断层机的受照剂量分别为(0.61±0.9)mSv和(1.72±0.2)mSv,分别是使用数字化曲面断层机的1.39倍(t=6.904,P<0.01)和1.55倍(t=-11.514,P<0.01),组间比较差异有显著性。结论:使用数字化曲面断层设备受照剂量明显低于普通曲面断层设备,值得在临床上推广应用。